PD-1的30年

2023-05-22

程序性死亡受体-1（PD-1）的基因于1992年由日本科学家Honjo在小鼠中分离、鉴定，在经历细胞死亡的T细胞杂交瘤中发现，因此得名。PD-1与CTLA-4、CD28和KIRs的结构具有相似性，人们因此猜测PD-1的配体可能是B7或MHC I家族成员。在2000年和2001年，Honjo和Freeman先后发现了PD-1与PD-L1（CD274；B7-H1）和PD-L2（CD273；B7-DC）相互作用的证据，共同阐述了PD-1/PD-L1对人体T细胞的调控作用，从而确定了PD-1途径。

2002年，耶鲁大学的华人教授陈列平发表的文章中指出大多数的肿瘤细胞通过表达PD-L1实现免疫逃逸，这为后面PD-1/PD-L1抗肿瘤药物的研发提供了重要的理论依据

PD-1的信号通路

PD-1受体是I型跨膜糖蛋白，属于CD28受体超家族成员。但与CD28不同，它在细胞表面是单体。在结构上，PD-1由细胞外免疫球蛋白可变结构域、跨膜结构域和负责信号和骨架分子结合的细胞质尾部组成。PD-1的细胞质尾部包含两个酪氨酸基序，一个ITIM（VDY₂₂₃GEL）和一个ITSM（TEY₂₄₈ATI）。两个结构域在PD-1配体结合时通过Lck的酪氨酸激酶活性磷酸化。

PD-1在活化的T细胞和B细胞、自然杀伤（NK）细胞、单核细胞、树突状细胞和癌细胞如黑色素瘤上表达。PD-1通过与PD-L1结合而被激活，并且与PD-L2具有更高的亲和力。两者的表达都是干扰素/细胞因子诱导的，但具有特定的表达模式：PD-L1在造血细胞和非造血细胞中广泛表达，而PD-L2主要在APC上表达。

在免疫细胞中，PD-1信号依赖于酪氨酸磷酸酶SHP-2。PD-1/SHP-2信号轴的破坏是肿瘤环境中对PD-1抗体产生临床反应的部分原因。配体结合后，SHP-2被招募到PD-1的磷酸化ITSM， ITSM的磷酸化诱导SHP-2向活性构象的转换。对重建的免疫突触的显微镜观察表明，在PD-L1的存在下，PD-1和CD28在TCR富集区中央发生关联。其中PD-1招募SHP-2，促进CD3ζ和CD28磷酸化的降低，并对TCR信号强度产生负面影响。PD-1促进的CD28去磷酸化深刻影响TCR信号体的PI3K募集，降低PI3K/AKT途径活性及其转录靶点，如Bcl-xL。此外，SHP-2被认为不仅负责阻断CD28共刺激信号，而且还负责抑制TCR介导的ZAP70磷酸化及其与CD3ζ的关联，这些信号会导致PKCθ和ERK激活以及下游IL-2的产生和扩增。

PD-1及其配体的作用方式

PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达模式不同。PD-L1广泛表达于造血细胞和非造血细胞。而PD-L2的表达比PD-L1更为有限，主要局限于造血细胞。PD-L1也在多种肿瘤类型的肿瘤细胞表达；尽管比PD-L1更为有限，PD-L2也在肿瘤细胞（如食管腺癌）上被观察到。

虽然PD-L1和PD-L2都与PD-1结合，但它们都有第二个不同的相互作用蛋白。PD-L1还可以结合B7-1（CD80），而PD-L2也可以结合排斥导向分子b（RGMb）。B7-1主要由造血细胞和抗原呈递细胞表达，而RGMb则表达于巨噬细胞、肺泡上皮细胞、神经组织和各种器官。

PD-1与PD-L1的顺式作用

典型的PD-1途径相互作用发生在活化T细胞上表达的PD-1与肿瘤、抗原呈递细胞（APC）或非造血细胞上的PD-L1之间的反式相互作用，并导致T细胞活化的抑制。如果PD-1和PD-L1都表达在同一细胞表面，那么PD-1和PD-L1之间也可以发生顺式作用，并且这种相互作用与反式相互作用具有相似的亲和力。

在非小细胞肺癌等肿瘤中，PD-1可与PD-L1在肿瘤浸润巨噬细胞、MDSCs、树突状细胞以及一些肿瘤细胞亚群上共同表达。顺式相互作用与反式相互作用竞争，导致抑制PD-1信号的PD-L1更少。考虑到PD-L1在一些肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）上的表达，PD-L1和PD-1在T细胞表面也可能发生顺式相互作用。反式与顺式PD-1/PD-L1相互作用的相对重要性可能取决于它们在相同或不同细胞表面的相对丰度，需要进一步仔细评估。

PD-L1与B7-1的相互作用

PD-L1可与B7-1结合，亲和力为1.4μM，约为B7-1对CD28（4μM）亲和力的3倍，但弱于PD-L1与PD-1（0.77μM）或B7-1与CTLA-4（0.2μM）的亲和力。

PD-L1与B7-1的相互作用只发生在同一细胞表面的顺式结构中。竞争结合研究和突变分析表明，PD-1和B7-1竞争PD-L1上的重叠结合区域。因此，B7-1与PD-L1的结合阻止了PD-L1与PD-1的相互作用，从而减少了PD-1抑制信号。

令人惊讶的是，B7-1与PD-L1的结合不会干扰B7-1与CD28的结合；因此，它们可以形成三聚体复合物，与CD28共刺激信号结合。PD-L1与B7-1结合对CTLA-4与B7-1结合的影响更为微妙。CTLA-4同型二聚体可以以高亲和力与B7-1同型二聚体结合，导致B7-1被Treg反式内吞。PD-L1与B7-1的结合将CTLA-4相互作用降低为单价，从而显著降低亲和力。这可以防止B7-1的去除，并减少任何T细胞固有的CTLA-4信号。

大多数PD-L1单抗都同时阻断PD-L1/PD-1和PD-L1/B7-1相互作用。在肿瘤免疫治疗中，这种类型的PD-L1单抗通过增强CTLA-4介导的同型二聚体B7-1的去除，导致APC上B7-1表达水平降低。这为PD-L1和CTLA-4联合阻断的临床试验提供了良好的理论基础。

PD-L2与RGMb的相互作用

PD-L2与T细胞上的PD-1结合抑制T细胞活化，PD-L2/PD-1的亲和力是PD-L1/PD-1的三倍。它们与PD-1的结合区域类似，因此，PD-L2和PD-L1竞争与PD-1的结合。虽然PD-L2的亲和力高于PD-L1，但其较低的表达水平为PD-L1/PD-1提供了竞争优势。

PD-L2的第二个结合蛋白是RGMb，它具有类似于PD-L2/PD-1的亲和力。RGMb是一种糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白，PD-L2可能与RGMb超复合物反式结合，以调节下游通路。PD-L2在该超复合物中的功能作用及其影响尚需进一步研究。

PD-1的功能

PD-1对TCR激活阈值的调节决定了T细胞对信号强度的反应范围，从而决定了它们的分化命运，包括耗竭和记忆形成。PD-1还在免疫抑制调节性T（Treg）细胞和先天免疫细胞的激活中发挥作用。受PD-1信号影响的这些不同因素决定了癌症免疫治疗反应的持续时间。

PD-1决定T细胞激活阈值

CTL成功激活后，被激活的T细胞的命运就会多样化。一些细胞保持其作为效应T细胞的活性，而另一些细胞由于过度刺激而变得无能、进入耗竭状态或发生凋亡。CTL的PD-1表达提高了激活信号的阈值，并抑制了连续的过度刺激。

为了增加癌症免疫治疗的持续时间，通过PD-1阻断降低激活阈值来增加T细胞储备是至关重要的，这可以增加T细胞识别和攻击肿瘤细胞的机会。包括记忆前体在内的活化T细胞的增加也导致长寿命T细胞的增多，这是持久反应的重要因素。

PD1和记忆T细胞生成

适应性免疫反应的标志之一是抗原清除后形成免疫记忆。免疫记忆反应使宿主在再次遇到相同抗原时能够更快地作出反应。PD-1信号可通过多种不同机制影响记忆反应。首先，TCR信号的强度与长寿命中央记忆T细胞的形成呈负相关。因此，效应器期PD-1信号的丢失将导致更强的TCR信号，从而导致记忆T细胞反应受损。从机制上讲，最近的研究表明，表达高水平CD62L的记忆前体细胞群和对DNA损伤的反应能力的增强对于长寿记忆群体的形成非常重要，而包括PD-1和淋巴细胞激活基因-3（LAG-3）在内的抑制性受体对于维持这一群体非常重要。

其次，PD-1通路在调节原始T细胞向记忆T细胞的分化以及调节现有记忆T细胞群的反应方面具有独特的作用。例如，在CD8+T细胞对流感感染反应的不同阶段使用PD-1抗体的研究表明，在感染后期（从第21天开始）阻断PD-1通路会导致记忆性T细胞数量增加，并产生炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α。此外，在鼻内痘苗病毒应答再激发期间阻断PD-1可以克服由于缺乏CD4+T细胞导致的记忆缺陷。

最后，PD-1通路影响记忆T细胞的维持和功能能力可能还取决于环境，其机制目前尚不清楚。因此，进一步阐明PD-1通路参与宿主免疫的宿主因素，对于继续改善基于PD-1的患者免疫治疗至关重要。

PD-1抑制Treg细胞功能

现在已经认识到PD-1可以调节传统αβT细胞以外的多种细胞类型。Treg细胞是一个特别令人感兴趣的群体，因为这些细胞在免疫调节中起着关键作用。至少有一部分Treg细胞表达PD-1受体水平升高，从而通过调节PD-1通路来调节这一群体。

体外研究发现，表达更高水平PD-1的人类Treg细胞倾向于降低抑制能力并增加IFN-γ的产生。在小鼠模型中，来自PD-1缺陷或抗PD-1治疗小鼠的Treg细胞具有更好的抑制能力。在肿瘤中，PD-1阻断导致PD-1+CD8+T细胞功能增强以及PD-1+Treg细胞介导的免疫抑制增强。治疗开始时，PD-1+CD8 T细胞与PD-1+Treg的比率可能会指导最终免疫反应的结果。因此，在检查这些疗法对患者总体预后的影响时，必须考虑PD-1抑制剂对这些对立细胞群（效应细胞与调节细胞）功能的集体影响。

PD-1抑制剂在临床的新用途

2014年，FDA首次批准将阻断PD-1的抗体用于治疗晚期或转移性黑色素瘤。自那时以来，阻断PD-1或PD-L1的抗体已被批准用于20多种晚期癌症。常见实体瘤的总体缓解率（ORR）一般为20-30%。PD-1或PD-L1药物在胶质母细胞瘤、微卫星稳定型结肠癌、胰腺癌或前列腺癌中的疗效有限。

鉴于这一成功，人们期望扩大PD-1抑制剂在早期癌症中的应用，包括新辅助和辅助治疗。最初，在一项针对21例可切除早期NSCLC患者的小规模II期试验中，首次评估了新辅助PD-1阻断剂对早期NSCLC的治疗作用。在20名患者中，有9名（45%）患者出现了主要的病理反应，即手术样本中存活的肿瘤细胞少于10%。在9名接受评估的患者中，有8名患者在PD-1抑制后发现肿瘤和血液中T细胞克隆的多样性增加。这些结果促使了许多更大规模的新辅助PD-1抑制剂的研究，包括CheckMate 816、KEYNOTE-671和Impassion030。

最近，OpACIN-neo的临床研究结果表明，接受新辅助PD-1或PD-1/CTLA-4联合阻断的局部晚期黑色素瘤患者的病理反应率较高。汇总分析发现，在52%实现pCR或近pCR的患者中，2年无复发生存率为96%，总生存率为100%。这意味着比在辅助治疗中接受PD-1或PD-1/CTLA-4联合阻断的患者60%的2年无复发生存率显著改善。当考虑到III期黑色素瘤的大多数复发发生在手术后的头两年内时，可以进一步认识到这一益处的重要性。此外，OpACIN-neo对三种给药方案进行了测试，发现较低剂量的ipilimumab治疗方案与低irAE发生率相关，同时保持77%的高病理应答率。

在一项纳入II期和III期乳腺癌患者的新辅助治疗临床试验中，接受PD-1抑制剂和化疗的三阴性乳腺癌癌患者手术时的pCR率为60%，而仅接受化疗的患者为22%。激素受体阳性癌症患者的pCR发生率为30%，而仅接受化疗的患者为13%。其他试验也有类似的结果，目前正在进行评估早期乳腺癌围手术期治疗中PD-1抑制的其他III期试验。

胶质母细胞瘤（GBM）是一种致命的恶性肿瘤，缺乏有效的治疗方法。到目前为止，PD-1抑制剂在复发性胶质母细胞瘤中的试验未能显示生存益处超过标准护理。然而，最近的研究结果表明，在新辅助治疗环境中，PD-1抑制可能有益。在最近的一项II期研究中，接受新辅助PD-1抑制剂的患者中位总生存期显著延长（13.7个月vs 7.5个月，p=0.04），无进展生存期延长（3.3个月vs 2.4个月，p=0.03）。此外，在包括乳腺癌和晚期错配修复缺陷型（MMRd）结直肠癌中，PD-1抑制剂新辅助治疗都显示出明显的临床获益。

小结

自从30年前PD-1通路首次发现以来，我们在揭示PD-1通路的复杂性方面取得了长足的进步。最近的研究在PD-1及其配体的作用方式，以及PD-1在调节不同分化状态的T细胞方面取得了一些新的见解，有助于深入了解这一重要免疫调节途径的多方面功能。对这些发现的进一步研究将继续影响我们对PD-1途径的理解，以及如何有效和安全地将PD-1调节应用于不同的患者群体。