赛诺菲开发了基于减毒RSV疫苗的生产工艺，此工艺采用Vero细胞进行病毒的扩增，Vero细胞的培养采用含10%血清的DEME培养基，病毒感染MOI为0.001，感染结束后继续培养6天。收获的含病毒料液经过核酸酶处理，过滤澄清，然后经复合模式填料Capto Core 700纯化，以去除宿主蛋白及宿主核酸，此层析步骤的上样量可达10 CV，相对于传统分子筛的常规上样量 (0.01~0.05 CV) 具有显著优势。Capto Core 700的流穿液采用500 KDa的中空纤维膜柱进行浓缩和换液。此工艺整体的回收率为50~60%，层析步骤的收率达到100%，宿主蛋白和宿主核酸的去除率达到99%以上，最终原液中每10 ng VERO宿主核酸病毒含量可达1.1 × 10⁸ PFU 。

重组蛋白RSV疫苗的表达体系可以是CHO细胞或昆虫细胞。本文以葛兰素史克的CHO细胞表达的重组RSV疫苗为例进行介绍，细胞培养过程采用fed batch模式，细胞培养密度达10-14×10⁶ cells/ml，表达滴度达0.8 g/L，此工艺步骤培养基可以选择ActiPro基础培养基及Cell Boost 7a/7b补料培养基。培养结束后，采用两级的深层过滤以去除细胞碎片等杂质，深层滤器可以采用Stax Disposable Depth Filter PDP8/PDE2类型的深层滤器，然后经过0.2 µm过滤器过滤以降低微生物负荷。

澄清后的料液经过吐温80孵育进行病毒灭活，第一步层析为亲和填料Capto DeVirs对病毒灭活后的料液进行捕获，RSV Pre F蛋白可以与Capto DeVirs结合，大量的宿主蛋白流穿，经过高盐洗脱，蛋白得到提纯并起到浓缩的作用。第二步层析为离子交换层析，采用Capto Q ImpRes高分辨阴离子交换填料，结合洗脱模式用于去除宿主蛋白、宿主核酸，这同时也是病毒清除的步骤。第三步层析为复合模式层析，采用Capto Adhere阴离子与疏水相互作用复合填料的结合洗脱模式，该步骤主要用于去除高低分子量的产品相关杂质和宿主蛋白，另外，还具有有效的病毒清除效果，对于MuLV可以降低4.81个Log，对于MVM可以降低3.15个Log。Capto Adhere洗脱液经过纳滤膜过滤以进行病毒去除，可以选用20 nm的 Pegasus SV4系列滤器。最后再经过50 kDa的超滤膜进行浓缩及缓冲液的调整。

mRNA类疫苗工艺包括了质粒模板的制备、mRNA的合成与纯化、LNP的制备及无菌灌装等步骤。质粒的制备工艺可以选择Cytiva的经典三步法工艺和改进两步法工艺:

mRNA的合成工艺可以选择Wave或XDR一次性生物反应器进行酶促反应，优化的参数包括DNA模板、NTPs及RNase抑制剂浓度、离子浓度、酶活性、孵育pH、时间及温度等。mRNA纯化工艺一般采用Oligo dT亲和层析进行捕获，去除酶类、NTP及模板DNA等工艺相关杂质，采用高分辨的疏水或离子填料进行精细纯化，去除片段或dsRNA等产品相关杂质。

捕获层析除了用亲和层析，还可以选用复合模式层析填料Capto Core 700/400，葛兰素史克采用Capto Core 700用于自复制mRNA的纯化，相对于其他的工艺方案有更高的回收率及更低的杂质含量。此后，杜克人类疫苗研究所及伊利诺伊大学分别采用Capto Core 700作为mRNA捕获层析的平台工艺。相比于Oligo dT亲和层析，采用Capto Core 700复合模式层析具有如下优点：

mRNA形式的RSV疫苗依然可以采用Capto Core 700作为捕获层析的填料，在可操作性及成本上都具有显著优势。精细纯化可以选择高分辨的疏水填料，如Capto phenyl ImpRes或Capto Butyl ImpRes，或高分辨离子交换填料，如Capto Q ImpRes或Source 30 Q。

目前，用于RSV疫苗的病毒载体类型主要有腺病毒载体和痘病毒载体。已批准上市的腺病毒载体新冠疫苗具有较为成熟的生产工艺，以腺病毒载体疫苗为例，病毒生产工艺采用HEK293细胞培养和病毒的感染，细胞培养采用无血清悬浮培养基CDM4HEK293，感染结束后可以用表面活性剂对细胞进行裂解、核酸酶进行宿主核酸的降解，裂解液经深层滤器进行澄清。澄清后料液经300 kDa的中空纤维进行浓缩及换液，而后经过Capto Q ImpRes初步纯化及Capto Core 700精细纯化，层析后料液通过300 kDa中空纤维进行超滤浓缩换液得到最终的疫苗原液。工艺流程图如下图所示。

以上概述了四种类型的RSV疫苗的工艺方案。