大而不同：简述IgM及其纯化策略

Wang Hongxiang 2023-04-14

免疫球蛋白M (IgM) 基于免疫球蛋白重链恒定区编码基因的不同，参与哺乳动物体液免疫的抗体类型主要包括了IgM、IgD、IgG、IgE与IgA。纵观免疫球蛋白的进化史，IgM是其中最古老的一种抗体类型。在宿主抵御病原入侵的免疫响应过程中，每种类型的抗体都有其独特的功能效应，IgM最初表达于B淋巴细胞表面，参与构成B细胞表面受体 (BCR) ，B细胞活化后可由浆细胞产生分泌型IgM (sIgM) 参与早期体液免疫应答。

免疫球蛋白M (IgM)

基于免疫球蛋白重链恒定区编码基因的不同，参与哺乳动物体液免疫的抗体类型主要包括了IgM、IgD、IgG、IgE与IgA。纵观免疫球蛋白的进化史，IgM是其中最古老的一种抗体类型。在宿主抵御病原入侵的免疫响应过程中，每种类型的抗体都有其独特的功能效应，IgM最初表达于B淋巴细胞表面，参与构成B细胞表面受体 (BCR) ，B细胞活化后可由浆细胞产生分泌型IgM (sIgM) 参与早期体液免疫应答。

IgM概述

IgM的单体大小在190 kDa左右，重链由一个可变区 (Vμ) 和四个恒定区 (Cμ1-4) 组成，轻链由一个可变区和一个恒定区组成 (Vκ‐Cκ/Vλ‐Cλ) ，在重链的C端还有一条18个氨基酸短肽对于IgM的多聚化至关重要，且将该序列整合至其他类型的抗体分子也能促使其产生多聚体。在哺乳动物血清中，sIgM通常以五聚体 (pentamer) 或六聚体 (hexamer) 的形式存在，两者的分子量分别在900 kDa与1,050 kDa左右，其中五聚体是一个非正五边形结构，内含一个50°左右的缺口由J链 (J-chain) 占据以保持构象稳定（图1）。

图1：IgM单体、五聚体、六聚体结构示意图

由于IgM是体液免疫应答早期的主要抗体，通过在患者血清中检测特异性IgM已被广泛应用于许多传染性疾病的早期诊断工具。另一方面，虽然IgM不能介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用 (ADCC) ，但相比于IgG，多聚体结构使sIgM能够多价结合抗原并且更加高效稳定地结合补体C1q（图2），启动补体依赖的细胞毒效应 (CDC) 。同时，五聚体IgM中的J链还能够与上皮细胞表面的多聚免疫球蛋白受体 (pIgR) 结合，进而将IgM转运至黏膜表面参与黏膜免疫。

图2：IgM与IgG的补体结合活性差异

综上，IgM同样具有作为抗体药物的开发潜力，但相关的临床管线无论是在数量还是进度上仍与IgG存在很大差距（图3）。由于早期的IgM项目几乎使用的都是未经历抗体亲和力成熟天然抗体，具有较低的亲和力与特异性，因此效果大多不尽人意，但这些临床试验至少证明了IgM的安全性。通过对IgM的工程化改造，例如在J链处引入CD3抗体或其他配体分子使其发挥细胞桥接作用，能够使IgM的临床价值进一步提升。

图3：IgM药物临床试验历史

IgM纯化策略

无论是应用于病原感染的早期诊断还是疾病治疗，如何有效获得高纯度IgM抗体是我们必须要解决的问题。相较于IgG，IgM的分子量更大、溶解度更低且更易降解，盐浓度、pH、温度都会在很大程度上影响IgM的稳定性。因此在遵循CIPP纯化策略的基础上，对IgM的纯化需要有更多考量。

捕获 (Capture)

在捕获阶段，亲和层析仍然是IgM纯化的首选。

由于IgM的Fc段存在较大的空间位阻，通常认为Protein A难以用于IgM的亲和捕获，但这并非是绝对的，Protein A除了能够结合抗体Fc段，还可与VH3基因参与编码的重链可变区序列结合实现对抗体的捕获。因此对于IgM的纯化，以MabSelect PrismA为代表的高载量、高耐碱Protein A填料仍然是个值得尝试的选择。

在Protein A效果不理想的情况下，可以着眼于Fab段的其他结构域进行亲和填料的选择。其中Protein L具有广谱的抗体结合活性，能够特异性结合抗体kappa轻链可变区。Capto L目前已被广泛应用于天然或重组IgM的纯化，新推出的Mabselect VL通过对Protein L配基的改造，实现了载量、分辨率以及耐碱性的进一步提升。此外，针对轻链恒定区，可以尝试使用KappaSelect或LambdaFabSelect进行捕获（图4）。

图4：具有Fab片段结合活性的填料种类及结合位点

考虑到IgM的稳定性，Protein A/L低pH的洗脱条件对于部分IgM可能有些剧烈，这种情况下可以选择其它类型的亲和介质。由于IgM具有大量的二硫键，基于嗜硫亲和原理的PlasmidSelect系列填料也非常适用于IgM的纯化，针对重组IgM，使用HiTrap IgM Purification HP 进行一步层析可同时实现高纯度与高收率（图5）。

图5：HiTrap IgM Purification HP纯化重组IgM

中度纯化 (Intermediate Purification)

多数情况下，仅依靠一步亲和层析难以达到对纯度的要求，尤其是对于血清或腹水来源的天然IgM样品，上述亲和介质难以区分IgM与其他类型的抗体分子。鉴于IgM具有分子量大的特点，可以通过分子量差异对IgM进行第二步纯化。传统的凝胶过滤由于上样量小且流速低，层析过程比较耗时，不利于维持IgM的稳定。同样基于尺寸排阻原理开发的Capto Core 400/700两款填料外部包裹了一层惰性多孔外壳，分别能将分子量大于400与700 kDa排阻在外直接流穿，内部偶连了强吸附的多模式配基，能够将进入内孔的杂质全部截留（图6）。经清洁再生后，填料可重复使用。相较于传统的凝胶过滤，采用流穿模式的Capto Core能够支持更大的上样体积和更高的流速，综合效率提升了100倍，更加适合IgM的纯化。

图6：Capto Core结构示意图

精纯 (Polishing)

阴离子交换层析能够有效去除样品中的HCP、HCD、内毒素以及病毒。人IgM的等电点分布范围大致在5.5-7.4之间，根据不同IgM分子的实际等电点，可灵活采用流穿模式 (FT) 或结合洗脱模式 (B/E) 。针对流穿模式，Capto Q系列以及Capto Adhere系列均能满足杂质去除需求。"另外，基于离子交换膜材料 Mustang Q 开发的系列产品具有吸附效率高、流速快的特点，适合以流穿模式去除痕量杂质。"但如果采用结合洗脱模式，就需要考虑填料载量的问题，这时以Capto Q XP为代表的大孔径阴离子填料会更加合适。

表1：IgM纯化策略汇总

纯化阶段	填料选择
捕获	Mabselect PrismA、Mabselect VL、Capto L、KappaSelect、LambdaFabSelect Capto PlasmidSelect、PlasmidSelect Xtra、HiTrap IgM Purification HP
中度纯化	Capto Core 700、Capto Core 400
精纯	FT：Capto Q、Capto Q ImpRes、Capto Adhere、Capto Adhere ImpRes、Mustang Q (PALL) B/E：Capto Q XP