研究表明，连接子在ADC药物中起着关键作用，因为它的特性极大地影响了这些药物的治疗指标、疗效和药代动力学。稳定的连接子可以维持ADC在血液循环中的药物浓度，并且在细胞毒性药物到达靶点之前不会释放，从而导致最小的脱靶效应，提高ADC药物的安全性。

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ADC药物的结构组成

    抗体是一类快速增长的药物，在肿瘤学、自身免疫和慢性炎症疾病等领域发挥重要作用。得益于抗体药物的飞速发展，抗体药物偶联物（ADC）作为靶向治疗药物也取得了重大进展。抗体药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）是一类抗体、连接头和细胞毒性药物组成的靶向生物药剂，以单抗为载体将小分子细胞毒性药物为靶向方式高效地运输至目标肿瘤细胞内发挥抗肿瘤的作用（图1）。ADC 类药物包含三种组分：①高特异性和高亲和力的抗体；②高稳定性的连接子；③高效的小分子细胞毒药物。

图1.ADC药物的结构组成

    ADC的成功发展取决于以下两个因素。首先，连接子的选择是至关重要的，主要体现在:1、高血浆循环稳定性，以防止药物过早释放; 2、维持单克隆抗体的性质和细胞毒性药物的细胞杀伤能力，同时降低全身毒性; 3、高水溶性，允许亲脂性药物的生物偶联和防止抗体聚集;4、在适当的情况下释放药物以使治疗效果最大化。其次，成功的ADC开发还依赖于合适的药物抗体药物比（DAR），低DAR会降低ADC的疗效，而高DAR通常会导致ADC不稳定，增加全身作用，缩短半衰期，并改变分子的药代动力学特性。

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ADC的关键组件：抗体和有效载荷

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单克隆抗体 

    ADC的一个重要组成部分是单克隆抗体。选择用于ADC设计的抗体的基本前提是它能够特异性地识别并结合到肿瘤抗原受体，并在此过程中将负载传递到肿瘤细胞。此外，该抗体还必须具有对特定靶抗原的高结合亲和力、低免疫原性、在血流中的明显稳定性和低交叉反应性。

    目前，ADC设计中使用的抗体大多来自人免疫球蛋白G（IgG）亚类（IgG1, IgG2, IgG4），由两条重链和两条轻链组成。ADC靶向抗原必须在肿瘤细胞[39]上高表达，并且还应具有内化特性，以增强受体介导的ADC内吞作用。目前，Nectin4、CD79b、CD22、CD33、HER2、CD30、FOLR1和TROP2是ADC中最具靶向性的抗原。此外，超过70种其他抗原正处于不同的临床开发阶段。

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有效载荷 

    有效载荷是用来杀死癌细胞的强效药物。一般来说，有效载荷需要具有最大的血浆稳定性和体外肿瘤细胞亚纳摩尔IC₅₀值，因为只有1-2%的注射ADC到达肿瘤。细胞毒性药物通过血液输送到全身。目前，奥瑞他汀类和美登素类是ADC发展中最常用的药物（图2）。

图2.常见的ADC有效载荷

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ADC中的连接子

    连接子是ADC设计中必不可少的组件，它通过共价偶联方式将抗体与细胞毒负载连接起来。连接子的关键要求是它必须确保ADC在血液中的化学稳定性（即半衰期比ADC长10倍左右），并允许在内化后在目标部位快速释放有效载荷。同时，连接子合适的亲水性/亲脂性可以增强有效载荷耦合和降低免疫原性的特性，也是连接子的一个关键方面。

    ADC中的连接子包含两种类型的连接子，即可裂解和不可裂解（图3）。这些连接子在决定ADC的药代动力学特性、选择性、治疗指数方面起着主要作用。

图3.ADC的连接子种类

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可裂解连接子 

    可裂解连接子在ADC中起着关键作用。它们在血液循环中长期稳定，并在肿瘤微环境中选择性释放有效载荷（图4）。

图4.可裂解的连接子

◆ 化学不稳定的连接子

    ADC中含有化学不稳定的连接子，包括酸可切割连接子和可还原连接子，利用血浆和细胞质间室之间的差异特性来释放有效载荷。第一类是酸或Ph敏感的连接链。这类连接子对碱性环境稳定，但对腙等酸性环境高度敏感。它们利用核内体（pH = 5-6）和溶酶体（pH = 4.8）的低pH值来触发不耐酸腙连接物的水解，随后释放负载。

    BR96-Doxorobicin（BR96-Dox）是使用酸敏感连接子构建的药物偶联物的一个很好的例子（图5）。该ADC是通过6-马来酰基己酸腙连接子将阿霉素与人源BR96单克隆抗体的半胱氨酸残基共价连接而成。腙在酸性条件被水解成肼和醛基，从而释放有效载荷。

图5. BR96-Dox结构

    此外，腙连接子也被用于Mylotarg和Besponsa这两款ADC。其中，Mylotarg是首个获得监管部门批准的ADC，用于治疗复发性急性髓细胞白血病（AML）患者。Mylotarg在复发患者中的初步临床研究于2000年获得批准。

    然而，连接物的不稳定性和缀合物的异质性导致药物在到达靶位点之前过早释放，因此，美国FDA于2010年主动从市场上撤回这款ADC。然而，由于它带来的收益超过风险，该ADC后来在2017年被重新批准使用。

图6.Mylotarg的化学结构

    第二类是可还原的连接子，在ADC设计中，可还原性或谷胱甘肽敏感的二硫化物连接子是不稳定酸腙连接子的替代品。二硫键在血液循环中相对稳定，但被细胞内谷胱甘肽还原裂解以释放有效载荷。谷胱甘肽是一种低分子量硫醇，存在于细胞质（1-10 mmol/L）和细胞外环境（血浆中2-20µmol/L）。

    基于可还原连接链的例子之一是2011年Kellogg等报道合成了含二硫键的ADC huC242- spdb - dm4（IMGN242）。该ADC通过二硫键的连接子连接细胞毒素DM4，并且在二硫化物周围具有不同程度的空间位阻（图7）。ADC通过蛋白水解失去抗体，然后经过二硫键裂解释放活性药物。

图7. IMGN242的作用机制

◆ 酶切割的连接子

    化学不稳定的连接子通常具有有限的血浆稳定性，从而导致药物过早释放。在这方面，作为一种替代策略，酶可切割连接子在控制药物释放方面取得了临床成功。与化学不稳定的连接物不同，酶可切割的连接物利用细胞区室中独特的水解酶的高浓度来切割并释放药物。

    第一类是肽链型连接子。肽基连接子，也称为溶酶体蛋白酶敏感连接子，如缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）、苯丙氨酸-赖氨酸（phi - lys）和缬氨酸-丙氨酸（Val-Ala）二肽连接子，是ADC设计中应用最广泛的连接子。这种策略利用细胞内蛋白酶，如组织蛋白酶B，它识别并切割二肽键，从而导致细胞毒性药物的释放。

    由于不合适的pH条件和血清蛋白酶抑制剂，肽基连接子显示出更大的系统稳定性，快速释放目标中的有效载荷。在ADC开发中探索这些类型的连接子通常需要一个共轭间隔分子，因为有效载荷的体积很大。用于此目的最常用的试剂是对氨基苯甲酸酯（PABC）（图8），它显示出自裂解能力，从而促进未修饰有效载荷的释放。

图8.PABC自消除链的作用机制

    FDA批准Brentuximab vedotin（BV）的ADC是一个基于肽基连接子很好的例子，其中该连接子已被探索并取得了显著的临床效果（图9）。BV由MMAE通过组织蛋白酶b敏感的Val-Cit -对氨基苯甲酸酯（PABC）连接子偶联到抗cd30抗体组成。BV被内化到表达cd30的细胞中，二肽键经历蛋白水解裂解，然后PABC通过1,6消除过程释放MMAE。

图9. Brentuximab vedotin (BV)的作用机制

    另一种蛋白酶可切割的连接子是Val-Ala二肽连接物，它被用于开发许多含吡咯苯二氮平的ADC。代表例子为Rovalpituzumab（Rova-T;SC16LD6.5），它是一种靶向生物标志物特异性ADC，专门针对表达delta样蛋白3（DLL3）抗原的小细胞肺癌，目前处于三期临床（图10）。Rova-T由SC16抗体通过PEG8间隔体(即Val-Ala连接子)偶联到吡咯苯二氮卓（PBD）有效载荷组成。

    然而，这种药物体积庞大，需要使用自消除的PABC来直接释放有效载荷。与BV相似，Rova-T首先经历Val-Ala连接子的蛋白水解裂解，然后PABC经历自消除过程释放药物。

图10. Rovalpituzumab的释放机制

    第三类是基于β-葡萄糖醛酸苷酶的连接子。糖苷酶，如β-葡萄糖醛酸酶，是一类水解溶酶体酶，可将β-葡萄糖醛酸残基降解为多糖。与组织蛋白酶B类似，β-葡萄糖醛酸酶在一些肿瘤的坏死区域分泌。

    β-葡萄糖苷酸酶敏感的ADC是通过将β-葡萄糖苷酸连接子与自消除的PABC间隔分子共价结合细胞毒性药物和抗体上。引入自消除间隔的连接子可增加ADC药物稳定性，并安全释放强效细胞毒素（图11）。药物的释放分两步进行:(i)糖苷结合的酶解;(ii)连接子的自发裂解，导致活性化合物的释放。

图11.基于β-葡萄糖醛酸苷酶的连接子

    第四类是基于β-半乳糖苷酶裂解的连接子，β-半乳糖苷酶可以降解半乳糖与其有机部分之间形成的β-糖苷键（图12）。与β-葡萄糖醛酸酶类似，β-半乳糖苷酶在某些肿瘤中过表达，在肿瘤中它水解β-半乳糖苷键，释放药物。

图12. 基于β-半乳糖苷酶裂解的连接子

    最后一类是基于磷酸酶切割的连接子。磷酸酶属于另一类重要的酶可切割连接蛋白，它们只表达于溶酶体区室中的靶酶。这些连接子以焦磷酸酶和酸性磷酸酶为目标，它们将焦磷酸酶和末端单磷酸水解成各自的醇，从而释放有效载荷（图13）。

图13.基于磷酸酶切割的连接子

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不可裂解的连接子 

    不可劈裂的连接子分为两类，即硫醚或马来酰亚胺基己酰基（MC）。它们由稳定的键组成，防止蛋白水解裂解，并确保比其可裂解的对应物更大的稳定性（图14）。含有这种类型连接子的ADC依赖于抗体的完全溶酶体酶降解来释放内化后的有效载荷，从而导致连接子的同时分离。

    目前，基因泰克/Immunogen公司已经成功探索了这种连接子策略，如临床批准曲妥珠单抗emtansine（KADCyla/T-DM1）。该ADC含有不可切割的SMCC (N-琥珀酰亚基-4-（马来酰亚甲基)环己烷-1-羧酸）连接子，将DM1细胞毒素连接到抗HER2单抗曲妥珠单抗的Lys残基上。

    不可切割的连接子相对于可切割的连接子的优势是其等稳定性提高。总的来说，不可切割连接子比可切割连接子提供了更大的治疗窗口，因为不可切割ADC也可以杀死靶细胞。

图14.不可切割的连接子

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ADC药物开发现状

    ADC对癌症治疗的重要性体现在市场上和处于临床研究中ADC药物数量的不断增加。目前市场上有12个获批准的ADC（图15）。并且，开发新型ADC的大量研究工作仍在进行中。目前有超过80个ADC正在进行临床试验。当下的ADC药物备受资本青睐，竞争空前白热化。

图16.已上市的ADC药物汇总

— 小结 —

    据统计，FDA在过去五年中批准了10种ADC，这意味着这些年来批准的所有药物中约有4%是ADC。多项研究均表明，合适的连接子仍然是一个成功ADC的重要支柱。通常，连接子必须在循环中保持稳定，并保证有效载荷在细胞内的安全释放。

    鉴于连接子通常会影响ADC的稳定性、毒性、药代动力学特性和药效学，因此在ADC设计中选择连接子时必须非常谨慎。此外，连接子必须考虑细胞毒性药物上的反应基团，包括单抗和衍生官能团。

    目前，临床阶段的大多数ADC使用常见的Lys和Cys残基进行偶联。在这种情况下，研究人员正致力于研究开发新的连接子。例如，光敏ADC连接子和生物正交可切割连接子等。尽管这些连接子具有一些优点，如特异性、效力和低毒，但含有它们的ADC仍处于起步阶段。

    但开发新型连接子的前景是非常广阔的，新的连接子的开发将进一步丰富ADC的设计策略，以进一步提高ADC的临床价值！

参考文献：

1.Linkers: An Assurance for Controlled Delivery of Antibody-Drug Conjugate. Pharmaceutics 2022, 14, 396.

2.Antibody-drugconjugates: Recent advances in linker chemistry. Acta Pharm Sin B. 2021Dec;11(12):3889-3907.

3.Antibody–Drug Conjugates: A Comprehensive Review. Mol. Cancer Res. 2020, 18, 3–19.

4.Antibody-drug conjugates for cancer therapy:Chemistry to clinical implications. Pharmaceuticals 2018, 11, 32.

5.Antibody–drug conjugates: An emerging concept in cancer therapy . Angew. Chem. 2014,53, 3796–3827

文章来源于同写意Biotech ，作者Shawshank
内容来源：药渡    
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