简介

4000 多年来，深层过滤一直是净水技术的重要组成部分。公元前 1500 年左右的梵文书籍描述了使用沙子和砾石过滤来生产饮用水。第一个市政净水系统（于 1800 年代初在苏格兰建造）将沙子和砾石过滤作为水处理的关键组成部分。

深层过滤在生物工艺领域也有着悠久的历史。最初的 Cohn 冷乙醇血浆分离工艺在纯化白蛋白和血清 IgG 的制备中使用以硅藻土作为助滤剂的深层过滤去除悬浮颗粒，石棉纸垫用于最终液体蛋白质溶液的除菌过滤。使用这些早期过滤器的主要挑战之一是无机物析出到产品溶液中。

许多与这些早期深层过滤器相关的问题已通过合成/半合成深层过滤器的开发得到解决，这些过滤器具有良好的可溶出物/可析出物特征，专为生物工艺应用而设计。许多研究表明，进入产品液流的任何成分都可以很容易地通过后续的下游工艺步骤去除，尤其是结合/洗脱层析以及最终的超滤/洗滤过程。作为一次性多产品生产设施的一部分，深层过滤器特别有吸引力，它可以最大限度地降低交叉污染的风险，同时消除清洁步骤。最近细胞密度和产物滴度的增加重新引起了人们对使用深层过滤去除细胞碎片和杂质的兴趣。此外，专门设计的深层过滤器可用于过程中液流的预处理，以去除关键污染物，从而提高后续层析或过滤步骤的性能。这篇综述重点介绍了在生物工艺中使用深层过滤的原理、应用和新机会。

深层过滤原理概述

与膜不同，深层过滤器通过大小（筛分/过滤）和分子间相互作用（例如带相反电荷的表面之间的静电吸引和疏水相互作用）的组合，在多孔结构的整个深层部分截留颗粒和杂质。Iwasaki 开发了第一个基于简单的一阶去除过程的深层过滤数学模型：

其中 N 是颗粒/杂质的局部数量浓度，z 是进入深层过滤器的距离（从进料表面测量），l 是描述颗粒/杂质去除效果的“过滤器系数”。公式 (1) 预测通过过滤器深层的颗粒浓度呈指数衰减。

深层过滤器性能的更复杂模型解释了布朗运动、拦截和沉降对去除效率 h 的贡献：

其中 e 是过滤器中的空隙率。颗粒去除效率通常在中等粒径时最低；非常小的颗粒通过布朗扩散（加上吸附）有效去除，而非常大的颗粒则基于物理筛分或拦截被捕获。

大多数用于生物工艺的深层过滤器由纤维素或聚丙烯纤维制成，并在介质中嵌入适当的助滤剂（例如硅藻土、活性炭或珍珠岩），以提供高表面积以增强杂质去除。纤维和助滤剂用聚合物树脂（“粘合剂”）粘合在一起，为过滤器提供所需的机械强度（图 1）。粘合剂通常带正电荷，以增强去除带负电荷的杂质，如 DNA 和许多宿主细胞蛋白质。深层过滤器通常采用类似于造纸工艺的湿法（无纺布）工艺制成。由此产生的平板过滤器可以结合到一个封闭模块中，该模块可以容纳在一个小滤芯中（用于工艺开发工作），或者可以进一步组装成一个堆叠外壳，用于大规模应用；这消除了与旧的板框设计相关的许多不便。这些大型过滤器通常使用蒸汽或 1 N NaOH 进行在位灭菌/消毒，然后用水和/或缓冲液冲洗，以去除微量颗粒并降低可析出物的浓度。

PDH4 深层过滤介质的 SEM 图像，显示纤维素纤维、硅藻土和聚合物粘合剂。

CHO 细胞悬液澄清过程中，不同深层过滤器的压力分布和处理量（上图）以及合并池浊度（下图）的比较。

在过滤血清 IgG 过程中，不同预过滤器对 Viresolve NFP 除病毒过滤器处理量的影响。

用于初步澄清的深层过滤器

深层过滤已成功用于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞悬液的初步澄清，可单独使用或与离心结合使用。离心分离时，细胞/碎片去除需要碎片和周围液体之间的显著密度差异，而深层过滤根据尺寸和吸附相互作用去除这些成分。因此，深层过滤器通常更有效地去除较小的碎片和细胞膜碎片。例如，Raghavan 等人表明，Seitz HP PDP8 深层过滤器与较小孔径的 Seitz Bio 10 串联，可高效澄清 HEK293 细胞中产生的腺相关病毒 (AAV)。Labisch等表明，在慢病毒载体的澄清工艺中，添加硅藻土作为助滤剂可提供更高的浊度去除率。此外，深层过滤器为初始澄清提供了完全一次性（可抛弃）的低成本选择。

图 2 显示了处理量的典型数据，在大约 1.5 bar的最大压力限制以及混合浊度条件下，针对细胞密度为 28 x 10^6 cells/mL 、活性约为 75%的中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞悬液的澄清，评估了几种市售深层过滤器。最终缓冲液冲洗后，产品回收率均为≥95%。性能最好和最差的过滤器的处理量和浊度相差近 10 倍。MilliporeSigma 的 Clarisolve 深层过滤器具有分级密度结构，专为具有宽粒度分布的进料而设计，在提供最高处理量的同时，仍然实现 <10 NTU 的浊度目标。然而，需要注意的是，根据细胞悬液的特性，这些深层过滤器的性能特征可能会有很大不同。

过滤器处理量在批次之间和操作规模之间也可能有很大差异。Lutz等人建议使用 1.2–1.6 的安全系数来缓解这些差异。Kim 等人最近的工作结合计算流体动力学、停留时间分布测量和染料结合研究，强调了 Supracap 50 小型深层过滤器中复杂的流量分布。小型和大型过滤器之间的流量分布差异可能会对过滤器性能产生重大影响。

提高深层过滤步骤有效性的一种选择是向细胞培养液中添加絮凝剂。絮凝剂会改变进料的粒度分布，显著减少小碎片的数量。Singh等表明，添加聚合絮凝剂（例如壳聚糖）可以将急剧分级的 Clarisolve 过滤器的处理量提高 3 倍以上，同时还可以降低浊度。同样，Burgstaller 等人使用 pDADMAC 絮凝作为 mAb 生产连续澄清工艺的一部分，将所需的深层过滤面积减少了四分之一。然而，由于从产品中去除絮凝剂的挑战以及整个下游工艺复杂性的增加，絮凝并未在当前的工业化工艺中广泛使用。

用于澄清的深层过滤器还可以显著去除宿主细胞蛋白 (HCP)、DNA 和内毒素，从而减少后续下游操作（尤其是层析分离）的负荷。先前使用含有硅藻土或珍珠岩的深层过滤器进行的研究表明，HCP 和 DNA 主要通过带正电荷的聚合物粘合剂的静电吸引而被去除。Metzger等表明，来自 3 M 的 Emphaze 阴离子交换深层过滤器可以提供 3-log 的 DNA 去除率和 7-log 的内毒素去除率，两者都带有高负电荷。相比之下，Nejatishahidein 等人发现 Pall PDH4 介质中带负电荷的硅藻土可显著去除带正电荷的模式蛋白质。Millistak HC Pro X0SP 是一种全合成深层过滤器，截留等级为 0.1 mm，对带正电和带负电的 HCP 均显示出高结合能力。

用于过程中过滤的深层过滤器

深层过滤器也广泛用于提高后续过滤步骤的性能，最常见的是作为除菌过滤或除病毒过滤之前的预过滤器。例如，Bolton等人表明，由 MilliporeSigma 开发的 Viresolve 预过滤器可以使 Viresolve NFP 除病毒过滤器在处理血清 IgG 时的过滤能力提高 10 倍以上，远远超过其它预过滤器的性能（图 3）。这种处理量的大幅增加被证明是由于去除了 IgG 的单体疏水异构体，这些异构体可能与 Viresolve 预过滤器中的疏水硅藻土结合。Bieberbach等在使用 0.1 mm孔径疏水预滤器时，通过 Virosart1 HC 病毒过滤器过滤一些（但不是全部）单克隆抗体时，发现过滤能力有类似的改善。Stanevich等人表明，聚酰胺（尼龙）预滤器通过疏水相互作用去除单克隆抗体聚体，显著提高了 Viresolve Pro 除病毒过滤器的处理量。Du等人表明，基于尺寸的预滤器有效地去除了糖偶联疫苗产品中的大型聚体，显著增加了后续 0.2 mm 孔径除菌级过滤器的处理量。

许多深层过滤器还能够基于吸附（主要是静电）相互作用直接去除病毒和 mAb 聚体。例如，Venkiteshwaran 等人表明，由于强静电相互作用，来自 MilliporeSigma 的带正电荷的 X0HC 深层过滤器可以在低电导率下提供超过 4.8 log 的猪细小病毒 (PPV) 去除率。在水处理应用中使用阳离子改性纳米纤维素也证明了高水平的病毒去除。Stanevich等人讨论了使用聚酰胺 6,6（尼龙 6,6）预滤器通过疏水相互作用去除 mAb 聚体，显著提高了细小病毒截留过滤器的处理量。然而，由于可溶出物和可析出物（包括来自纤维素深层过滤器的 β-葡聚糖），在下游工艺后期使用深层过滤器可能会带来挑战。Holstein等人表明，在 pH 10 下使用 50 mM 碳酸钠和 0.5 N NaCl 优化过滤器冲洗，可以显著降低产品液流中的 β-葡聚糖浓度。

未来发展方向

尽管深层过滤在生物工艺中的应用历史悠久，但深层过滤器构造的最新进展以及生物生产的发展已经导致人们对深层过滤技术在许多关键应用中的兴趣重新兴起。首先，深层过滤器特别适用于处理高浊度的进料，考虑到对具有更高产品滴度的高细胞密度培养的推动，这种情况越来越多。其次，深层过滤器非常适合用于一次性生产设施。 Langer 和 Rader 报告说，一次性系统占临床前材料生产设备的 85% 以上，预计每年的增长率接近 20%。第三，深层过滤器已被证明对于澄清慢病毒和腺相关病毒非常有效，这两种病毒都是用于递送尖端基因治疗药物的极具吸引力的载体。持续努力的重点是开发处理量更大、更有效去除关键工艺和产物相关杂质以及更低水平的可溶出物/可析出物的深层过滤器。

生物工艺的另一个趋势是开发连续/连接的工艺，作为“强化”下游工艺的一部分。深层过滤器作为连接单元操作的一部分具有悠久的使用历史，例如，作为除病毒过滤或除菌过滤之前的在线预过滤器。尽管深层过滤本质上是一种批量操作，但 Thakur 等人提出了一种死端过滤装置，可用于连续生物工艺，在预先指定的浊度或压力端点自动切换平行过滤器之间的进料。该系统的有效性已在大肠杆菌、中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞和毕赤酵母的重组产物的初步澄清中得到证实。

此外，过滤器生产商继续开发新的深层过滤器产品，这些产品专为应对生物工艺中的独特挑战而设计。这包括开发特别适用于细胞/细胞碎片初步澄清的“急剧”分级深层过滤器。此外，Repligen 最近推出了 TFDF 过滤器，它在单一介质中结合了切向流过滤和深层过滤的优点，用于连续澄清来自灌流生物反应器的高细胞密度培养物。细胞悬液流过管状过滤器的内腔，壁厚 ~5 mm，由聚丙烯/聚对苯二甲酸乙二醇酯制成，用作深层过滤器，以增强澄清。Williams等人已经证明了这种过滤器在处理来自人胚肾 (HEK 293) 细胞的慢病毒载体方面的有效性。

生产商继续开发具有增强性能特征的新型深层过滤材料和结构。这对于连续工艺的运行尤为重要，在这种工艺中，通过深层过滤去除目标杂质可以显著延长层析柱、除病毒过滤器和除菌过滤器的使用寿命。这不仅减少了介质更换的频率，还最大限度地减少了工艺中断，并且更容易在数周的操作中保持生产过程的无菌状态。这些进步可能会在未来几年继续推动生物工艺行业深层过滤技术的发展。