根据单克隆抗体的作用机制，其糖基化的位点、 糖型种类及丰度都可能影响产品的有效性、安全性和质量稳定性，因此糖基化被普遍认为是单抗药物的关键质量属性 （CQA）之一。多数单抗产品的生产宿主细胞为哺乳动物细胞表达体系，由于生产工艺控制的程度不同，糖基化水平在不同厂家、不同批次之间经常存在差异，给这类产品的研发和审评带来了较大挑战。

单克隆抗体糖基化修饰多数为 N-连接的聚糖。IgG 型单克隆抗体一般在 Fc 段的 Asn-297 有一个保守的 N 糖基化位点，另外约 20% 的 IgG 在 Fab 区域存在另一个N-连接的糖基化位点，这两个糖基化位点都位于重链上。研究发现，单克隆抗体两条重链的糖基化程度多数情况下并不对称，进一步增加了糖基化抗体的多样性。

除 N-连接的糖基化外，极少数单克隆抗体药物中也存在 O-连接的糖基化。Fc 聚糖分子的核心结构是由 3 个甘露糖（Man）和 2 个 N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）分子组成的复杂“双触角型”五糖分子的结构，并且不同的糖型可含有不同数量的其他分子，如岩藻糖（Fuc）、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖 （Gal）、二等分N-乙酰葡糖胺和唾液酸（Sia）。糖链的长度、分叉的方式、单糖的排列顺序的差异造成了 N-聚糖复杂多变的结构。这种 N-聚糖的核心结构可通过各种酶的作用进一步多样化，总结起来大致可分为三种结构，即高甘露糖型、杂合型和复合型，其中杂合型和复合型在大多数情况下均存在核心岩藻糖基化（图 1）。抗体中常见的糖基化结构见图 2。

单克隆抗体与抗原分子结合后可以引发效应功能，效应功能由Fc段介导，Fc 与 Fc 受体或相关补体蛋白结合， 可引发抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）或补体依赖的细胞 毒作用（CDC）。单抗Fc段的糖基化水平可以影响 ADCC 和 CDC，并能改变抗体的药代动力学性质，部分糖型结构还能影响抗体的免疫原性。

ADCC由Fc与 Fc-γ 受体（FcγR）结合后引发，其结合力明显受CH2结构域中 N-聚糖影响，如降低/去除核心糖结构中的岩藻糖可以提高 ADCC效应。研究发现由 Lec13 突变株表达的岩藻糖敲除的 IgG 抗体，其与 FcγRIIIa 结合能力提高了 50 倍，ADCC效应提高了100 倍。抗体 N-聚糖核心结构中的岩藻糖是由于蛋白通过高尔基体时，在 α-1,6-岩藻糖转移酶的作用下从GDP-Fuc 上转移岩藻糖基而得。采用敲除或低表达 α-1,6-岩藻糖转移酶的工程细胞株，或其他途径降低 IgG 抗体中的核心岩藻糖水平， 可以达到提高抗体 ADCC 效应的目的。 

鉴于聚糖结构对抗体功能的重要影响，生产工艺中应严格控制糖型种类、比例和含量。细胞株、培养基、培养工艺都可能影响单抗产品的糖基化修饰水平。

不同宿主细胞由于内质网和高尔基体中糖基转移酶和糖苷酶配置不同，其表达的单克隆抗体的糖基化修饰一般都存在差异。单抗生产常用的均为哺乳动物细胞，包括 CHO、 BHK、HEK 293、PER.C6 等细胞，以及鼠骨髓瘤细胞 NS0、 SP2/0、Y0 等。CHO细胞是最常用的宿主细胞，主要是因为其基因组及扩增的稳定性较好，而且糖基化修饰稳定且类似于人的细胞系。但 CHO 细胞与人细胞系表达产物在唾液酸与半乳糖的连接方式方面有所不同，CHO 细胞缺少 α-2,6 唾液酸转移酶，只能产生 α-2,3 连接的唾液酸化聚糖；人细胞系则有两种酶能产生 α-2,3 和 α-2,6 连接的两种唾液酸化聚糖，且以 α-2,3 连接的唾液酸化聚糖为主。缺少 α-2,6 连接的两种唾液酸化聚糖可能导致单抗分子体内具有不同的半衰期。

另外 CHO 细胞缺少功能性的 GnTIII 酶，其可以阻断连接上二等分的 GlcNAc 残基。NS0 细胞则由于可以添加 α-1,3 半乳糖和 Neu5Gc 而不是 Neu5Ac，导致其表达产物在人体中引起较高的免疫原性。宿主细胞对单抗的质量有重要的影响，研发单位应该在立项开始即选择合适的宿主细胞，如在后期进行宿主细胞变更需要进行大量的试验对比研究。 

细胞的培养方式可以影响糖基化的种类和水平。有研究表明，从分批培养变更为分批补料式培养，即使补料成分不变，糖基化修饰有明显不同。而培养方式不变，只是规模扩大，一般不会影响糖基化水平。因此，在单抗产品的开发过程中，培养方式应慎重变更，进行规模扩大时应注意关键工艺参数（CPP）的一致性。

无血清培养基在单抗产品中已经得到广泛应用，然而与有血清培养相比，培养时间延长，更易造成糖基化的多样性和复杂性。培养基中的糖类等营养成分作为糖基化组成的结构片段或能量的来源，能够显著影响糖基化的异质性，分批补料培养方式可以在一定程度上保持糖含量的稳定，因此有利于糖基化水平的保持。

有研究证明培养基中糖含量提高后，CHO 等细胞表达的抗体分子中相应的糖基化修饰和唾液酸化水平均得到提高。低糖培养时，细胞将优先利用培养基中的糖满足能量需求，分配到糖基化修饰相应减少，分批补料培养基中去掉糖成分会导致了副产物的积累，减低了目标产物的糖基化水平。Mn2+ 是高尔基体中 β-1,4-糖基转移酶的辅因子，无血清培养基中 Mn2+ 与氨基酸成分的加入会造成更高的糖基化和唾液酸化。Mn2+ 自身并不足以造成最大程度的糖基化，必须与核糖类、半乳糖或尿苷类协同作用。

另外有研究发现，当用半乳糖等其他糖类替代培养基中的葡萄糖，且 Mn2+ 含量较高时容易造成高甘露糖型修饰。其他成分方面，丁酸钠可以通过阻断细胞周期特异地提高抗体的产量，但有报道培养基中加入丁酸钠可以减少半乳糖化和唾液酸化水平，增加抗体的电荷异质性。单糖在核糖存在时可以促进低聚糖天线形成，且核糖的存在对于糖型种类有重要影响。尿苷可以促进核糖合成，因此单糖、核糖、尿苷都可以影响产品的糖基化，进一步影响产品的质量。 

培养温度是影响细胞生长和产物质量的重要因素之一。应该明确的是，对细胞生长最适合的温度不一定适合重组蛋白生产。较低的培养温度（30 ~ 35 ℃）可以导致细胞周期阻滞在 G0/G1 期，具有最强的细胞活力和最低凋亡，表达产物的 mRNA 水平也较高。但较低温度时，细胞内的 UDP-GlcNAc 和 UDP-GalNAc 降低，糖分支合成酶水平下降，可能造成未成熟的糖基化修饰结构出现。 

溶氧、pH 值、游离氨、渗透压都可以影响抗体糖基化修饰的结构和水平。溶氧可能通过影响糖酵解途径或重链间二硫键的形成造成空间位阻进而影响到糖基化。氨或 pH 值可能通过影响细胞高尔基体内酶活性进而影响抗体糖基化修饰。渗透压常与培养基成分、pH值等因素联合影响糖基化水平。

蛋白糖基化中的聚糖为非模板合成，结构非常复杂，因此，糖基化结构表征难度远超核酸和氨基酸序列表征，一般需要综合生物活性方法和理化分析方法，并借助质谱等现代分析仪器进行片段分析和鉴定。生物活性测定可以通过测定受体和靶蛋白的结合或测定受体/靶蛋白结合后的生物效应实现。如采用表面等离子体共振法测定抗体与其靶抗原的结合、各种 Fc 受体亚型的结合，基于作用机制开发的细胞内报告基因活性分析方法，细胞毒性测定方法，测定 ADCC 或 CDC 效应等。

抗体片段水平的分析通常用胰酶等蛋白酶对抗体进行酶解，产生分子量为 0.5 ~ 5 kD 的小肽，采用色谱或电泳分离后再进行 MALDI-MS 或 ESI-MS 分析，可以提供氨基酸序列、糖基化结构和位点、微小的化学和酶修饰等信息。游离寡糖的分析通常采用酶法或化学试剂法使寡糖从完整蛋白中游离出来后，借助色谱-光谱（质谱）技术，可以对寡糖进行定性和定量分析。

近年来，随着新材料和检测设备的开发，生物制品领域一些先进的分析技术逐渐涌现出来。亲水作用色谱（HILIC）采用大孔径、2 μm以下的固定相使游离聚糖、糖肽和完整糖蛋白良好分离成为可能，再联合质谱的 HILIC-MS 技术可以获得不同糖型结构的定量信息，以便快速比较生物类似药与原研药的糖基化差异。二维（2D）色谱技术选用 IEX、 HILIC、RPLC、SEC、HIC 中两种不同分离原理技术进行偶联，垂直方向上互补的分离技术结合在一起更易于鉴定一些未知的蛋白变异体。

离子迁移色谱质谱（IM-MS）技术根据离子形状与电荷比实现分离，可以分离质量相同而形状不同的离子，其与质谱技术联用可为研究者提供更加丰富的结构信息，IM-MS 技术已经证明在糖基化修饰结构、位点，尤其是同分异构体的糖基化结构鉴定中发挥了重要作用，是一种极具前景的分离检测技术。这些分析技术的出现将大大提高对抗体糖基化的认知能力，使抗体药物的质量研究不断完善。

抗体的糖基化是一种复杂的翻译后修饰，对单抗药物的疗效、稳定性、免疫原性、药代动力学性质等具有重要影响。一般情况下公认的糖基化修饰如核心岩藻糖、唾液酸、高甘露糖水平等均被认为是产品的关键质量属性（CQA）。研发单位应该在开发过程中对糖基化修饰的可能影响进行文献调研，并结合动物或人体试验选择产品的最优糖型。生物类似药的研发单位应对参照药的糖基化修饰进行深入分析，从理化分析、生物活性、动物及临床试验分层次对糖基化“相 似性”进行评估。

FDA 生物类似药相关指导原则中关于糖基化的质量相似性评价一般得出“不够相似（insufficient analytical similarity）、未确定性相似（analytical similarity with residual uncertainty ）、实验性相似（ tentative analytical similarity ）、 指 纹 相 似 （ fingerprint-like analytical similarity）”4 个结论，建议质量研究（包括理化分析、生 物活性等）存在的不确定性，可以通过药代动力学、药效学 研究进一步评价，以此来确定理化分析后糖型相关参数的相 似性可接受范围。本文综述了抗体糖基化修饰结构、功能、工艺和质量控制方面的进展以及相关法规方面的思考，希望能为开发治疗性单克隆抗体药物及其他糖蛋白类生物仿制药提供参考。