当我拿到一系列的多肽候选药物的化学结构时，发现有一组（cohort）多肽分子中都含有一个赖氨酸的类似物，1,4-二氨基丁酸（Dab）或1,3-二氨基丙酸（Dap），内心顿时产生了不好的第一感觉。Dab和Dap都属于赖氨酸的类似物，同属这个组群的还包括鸟氨酸ornithine，它们都是侧链带有氨基的三官能团氨基酸（包括主链的氨基与羧基），不同点在于侧链亚甲基的数量。赖氨酸有四个亚甲基，分别称为β，γ，δ，ε碳（主链的碳为α碳），亚甲基数量按照赖氨酸，鸟氨酸，Dab, Dap的顺序依次减少（图1）。

图1. 赖氨酸，鸟氨酸，Dab和Dap化学结构

在这四种氨基酸类似物中，只有赖氨酸属于proteinogenic 氨基酸（蛋白氨基酸），鸟氨酸，Dab和Dap都属于non-proteinogenic 氨基酸。需要指出的是，proteinogenic氨基酸指的是那些在翻译期间被生物合成并入蛋白质的α-氨基酸。所谓的proteinogenic，指的是“蛋白质形成”。在已知生命体中，有22种蛋白质氨基酸，其中20种在标准遗传密码中，另外两种（硒半胱氨酸selenocystein和吡咯赖氨酸pyrrolysine）通过特殊的翻译机制引入。“非蛋白质氨基酸”并不是不存在于自然界的氨基酸，只是不通过翻译过程引入蛋白的氨基酸。例如D-氨基酸，它们都不属于蛋白质氨基酸，但在自然界中有存在。一些在自然界中出现的非蛋白氨基酸通过非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases）合成，并整合到非核糖体肽（nonribosomal peptides）中。鸟氨酸，Dab和Dap都属于自然界中存在的非蛋白质氨基酸。

自然界经过了漫长的进化过程选择了这22种蛋白质氨基酸（其中的20种加硒半胱氨酸为真核生物蛋白质氨基酸）是有着非常复杂的机制的，其中关键的一点在于它们可被核酶自动氨基酰化系统识别，从而由tRNA携带并被生物体在翻译过程种组装为蛋白质。

除了这个最基本的识别机制之外，某些氨基酸，例如鸟氨酸与高丝氨酸，它们自身的化学结构特征决定了它们的不稳定性。自然界在生物学功能的基础上，注定会选择那些具有更高稳定性的化合物作为合成生物体的原料，这或许就是为什么赖氨酸被选择，而鸟氨酸, Dab和Dap这样缺少了一些亚氨基的类似物，只得作为非蛋白质氨基酸，在post-translation的过程种被整合到生物体内的原因。

之所以看见Dab和Dab在多肽药物结构种会产生一种不祥的第一感觉，正是与这些赖氨酸类似物不被自然界选择为蛋白质氨基酸相关联的。如同鸟氨酸一样，Dab和Dap都会介导酰基N-N转移降解。Dab侧链的N^γ 氨基（因连接在γ碳上，故名）与Dap侧链的N^β都可以亲核进攻主链肽键（酰胺键）。Dab可以按照两种路线进行降解，路线A是Dab的N^γ 氨基亲核进攻C端氨基酸的肽键，形成一个五元环中间体，之后可以引发主链肽键断裂，形成两个多肽片段；路线B中，Dab的N^γ 氨基亲核进攻N端肽键，形成一个六元环中间体，再异构化为iso Dab异构体1。与Dab不同的是，Dap的N^β只进攻它N端氨基酸肽键，因为进攻C端肽键，需要形成一个四元环中间体，这在化学反应热动力学上是不占优势的，这个过程的结果为iso-Dap异构物2的形成（图2）。鸟氨酸ornithine会产生类似于Dab路线A的酰基转移降解而导致主链断裂，只不过它形成的中间体为六元环（因为鸟氨酸比Dab多一个侧链亚甲基）。这个酰基转移反应无疑为含有鸟氨酸，Dab或Dap的多肽稳定性带来潜在隐患。这或许就是自然界选择了赖氨酸而非鸟氨酸，Dab，Dap为蛋白质氨基酸的重要原因之一。

图2. Dab和Dap介导的酰基N-N迁移降解。

实际上，FDA批准的多肽类药物中，没有任何一款含有Dab或者Dap结构，包含鸟氨酸结构的也只有atosiban和Orinithine vasopressin两个。

回到项目中，药物设计者称，没有发现多肽分子的降解。这个多肽的结构有些特殊，D-Dab是连接在多肽分子中另一个L-Dab残基的侧链，而且这个侧链D-Dab在通过其N^γ 氨基与另外一条多肽连接，D-Dab单元在多肽分子中充当了linker的作用。在这个结构中，只能发生异构化的降解（由3异构化为4），而不会出现主链肽键断裂的情况（图3）。在面对“没有发现降解情况“的回答是，我总会追问，”如果发生了降解，你的分析手段一定能够检测到吗？“如果不能确定这一点，”没有发现降解“就可能成为一种把头埋在沙子里面的自欺欺人的做法。

图3. D-Dab多肽的异构化降解。

按照我的要求，研究人员首先合成了降解异构体4。使用当时的分析手段发现，4与3 在RP-HPLC中共洗脱，因此“没有发现降解“就成为一种无效的说辞。接下来，研究人员利用3和4两个参照物，开发出了能过够实现基线分离的RP-HPLC方法，以此方法作为分析手段，检测多肽3的稳定性。这种有的放矢的分析手段发现，多肽3在pH 4.5的条件下发生了明显的异构化降解，在研究时间内发生了50%的异构化，而这个比例在pH 6.4的环境中进一步加大。这个稳定性实验充分证明了多肽3的不稳定性。之所以异构体4的比例高于3，可能是因为异构体4的稳定性更强，这是一个热力学控制的过程。

这个项目因为工艺化学家的“干涉“而及时亮起红灯，如果没有这个稳定性的发现，制药公司可能会选取错误的分子作为药物candidate，对之后的临床试验造成相当的混乱。因此预测药物稳定性，尤其是异构化稳定性，对于项目的命运来说非常重要。药物分子设计部门的领导从美国来到欧洲，对我的”慧眼“表示了感激，这也是对我的多肽药物稳定性预测给予的充分肯定。

最后还是想要强调一点，预测药物稳定性，尤其是异构化的稳定性，一定要首先确保使用的分析手段能够检测降解物，这需要合成异构体降解物，开发分析手段，然后再进行稳定性测试。另外要说的一点是，Dab虽然可能导致多肽的稳定性问题，但它仍然是存在于自然界多肽中的，比如抗生素多肽polymixin (多黏菌素)，其家族成员colistin和多黏菌素B多肽中都含有很多L和D-构型的Dab残基，它们带的正电荷对于多黏菌素破坏细菌的细胞膜，治疗革兰阴性细菌的感染起到非常重要的作用，也在抗菌肽的分子设计中扮演重要角色。但对于含有Dab或者Dap结构的多肽，一定要首先确定它们的化学稳定性。

图4. 多黏菌素多肽colistin (左) 和 多黏菌素B (B1: R=H, B2: R=甲基)。