在摇瓶发酵工艺中，首先要考虑培养基，包括合适的营养成分，像碳源、氮源等，还要调好pH值和控制渗透压。之后需要确定装液量和接种量，并且要使用活力强、纯度高的菌种，要保证瓶内有足够空间用于微生物生长和气体交换。摇床参数方面，转速、温度和振幅很关键，不同微生物对转速要求有差异，温度控制要符合微生物生长和产物合成的需求，振幅要和转速配合好。溶氧控制也很重要，可通过增加气液接触面积、优化通气方式、控制发酵液黏度来实现。此外，要严格进行无菌操作，防止染菌，还要定期检查发酵情况。

根据微生物的营养需求，精确配置碳源、氮源、无机盐、生长因子等营养成分。如谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸时，常用葡萄糖、蔗糖等作为碳源，尿素、铵盐等作为氮源。摇瓶阶段的补料都是在取样阶段手动添加，摇瓶补料可以在一定程度上模仿发酵罐流加过程。

多数微生物有适宜的pH生长范围，需提前调好培养基的初始pH值。如黑曲霉发酵生产柠檬酸，适宜pH值在3.5-4.5之间；而枯草芽孢杆菌发酵生产淀粉酶，pH值一般控制在6.5-7.5左右。同上摇瓶pH也可以在取样阶段手动添加酸碱液进行调节，痛点在于工作量持续增加。

培养基中营养物质的浓度会影响渗透压，进而影响微生物的生长和产物合成。例如，高浓度的糖或盐会使渗透压升高，导致微生物细胞失水，抑制其生长和代谢。渗透压逻辑基于配方，可以做到与发酵罐保持一致。

一般装液量为摇瓶容积的30%左右。装液量过多，会减少摇瓶内的空气空间，导致溶氧不足；装液量过少，培养基易挥发，且微生物生长的营养物质有限。如250mL摇瓶，装液量50-75mL较为合适。我们知道发酵罐的装填系数一般在60%-75%，而摇瓶工艺开发过程中装液量少了一半，这是由于摇瓶瓶塞的透气率太差，因此如果是在配方筛选、流程建立的过程中使用硅胶砂芯塞、封口膜较为合理，如果是追求摇瓶阶段的高表达，或是摇瓶作为种子液活化扩陪，建议使用多层纱布。

要保证摇瓶内有足够的空间供微生物生长和气体交换。空间过小，微生物代谢产生的二氧化碳等气体无法及时排出，会抑制微生物的生长；空间过大，则会使微生物在瓶内的分布过于分散，不利于营养物质的充分利用和代谢产物的积累。

接种量一般为1%-15%。接种量过少，微生物生长缓慢，发酵周期延长，且易被杂菌污染；接种量过多，会使微生物在短时间内大量繁殖，消耗过多营养物质，产生代谢废物积累，抑制产物合成。摇瓶接种逻辑与发酵罐一致。

可选择底面积大、瓶颈长的摇瓶，或使用有挡板的摇瓶，以增加氧气与培养液的接触面积，提高溶氧效率，选用挡板摇瓶可以在一定程度上模拟发酵罐的混匀效果，增加传氧能力。

在摇瓶上安装通气管，通入无菌空气或氧气，通气速率一般为0.5-1.5vvm，可以实现对发酵罐的通气模拟；

发酵过程需在无菌环境下进行，包括培养基的配制、灭菌、接种、摇瓶的清洗和消毒等环节，防止杂菌污染。染菌操作注意事项与发酵罐相同，但对人员操作更加严格。

定期观察摇瓶内的发酵情况，如发现染菌迹象，如培养液变色、浑浊、有异味等，应及时停止发酵，并分析染菌原因，采取相应措施。发酵罐出现染菌的时候，由于各项成本比较高，因此可能采取不同的处理策略，比如重新灭菌上罐、提前收取产物、灭菌补料重新上罐等操作，摇瓶工艺及时收取数据即可，此处没必要模拟发酵罐。

转速影响溶氧水平和微生物与培养基的接触程度。不同微生物对转速要求不同，细菌一般150-250rpm，真菌100-150rpm。如大肠杆菌发酵，转速常设置在200rpm左右；酿酒酵母发酵，转速120rpm左右即可。通过挡板与摇床圆周运动组合实现发酵液的旋转，从而模拟发酵罐的搅拌形态。

振幅与转速共同影响溶氧和微生物的剪切力。大振幅转速宜慢，小振幅可适当提高转速。一般振幅在2-5cm之间。

发酵罐可以做到按照时序、级联或是基于反馈等进行控制条件设置。对于该控制逻辑的模拟可以采用能够提供分段控速、控温的摇床，这样可以更好的为微生物生长繁殖、代谢产出提供给良好的发酵条件：

微生物发酵不同阶段，其控温精准性作用关键。如酿酒酵母发酵酒精，各时期依需求控温，能促酵母生长、优化酒精产出并减少副产物。对于产物合成，像大肠杆菌表达重组蛋白，温度调整可提升蛋白质量。不同微生物特性各异，嗜热脂肪芽孢杆菌与嗜冷假单胞菌发酵时，分段控温适配其生理需求，保障酶合成与微生物代谢。此摇床还可提升实验效率，快速确定最佳温度策略，且因精确控温，实验结果稳定、可重复性强，极大推动发酵工艺开发进程，在微生物发酵领域意义非凡。

在摇瓶工艺开发中，分段控速摇床优势显著。发酵初期，对于脆弱微生物，如哺乳动物细胞，低速可减少机械损伤，利于其贴壁适应。微生物进入生长旺盛的对数期，溶氧需求大增，此时提高转速能强化气液接触，像细菌发酵那样，满足其快速生长与产物合成所需氧气。到了产物合成阶段，调整转速可优化环境，以酶发酵为例，能促进底物与产物扩散，规避产物反馈抑制。这种摇床能模拟自然环境中微生物的多种状态，在工艺开发时，可精准调控发酵各阶段转速，为筛选理想发酵条件拓宽范围，极大地提高了开发效率与精准度，有力推动摇瓶工艺的优化与完善，在微生物发酵技术领域极具价值。

大肠杆菌摇瓶发酵工艺设计（重组人胰岛素样生长因子-1，rhIGF-1）

1. 基础培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、葡萄糖5g/L，同时添加适量的微量元素溶液（含Zn²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺等）以满足菌体生长和蛋白表达需求；

2. 装液量：500mL 摇瓶中装液量为100mL，这样既能保证菌体有足够的营养物质，又能维持较好的溶氧水平；

菌种制备过程：

1. 接种量为 8%。使用经过活化和筛选的高表达rhIGF-1 的大肠杆菌工程菌株，通过甘油管保存菌种，在接种前先在平板上划线活化，挑取单菌落接入种子培养基，培养至对数生长期后按比例接种到摇瓶发酵培养基中；

2. 摇瓶扩培：将活化后的斜面菌种，在无菌环境下用接种环挑取一环，接入装有 50-100mL LB 液体培养基的250mL 摇瓶中，在37℃、180-200rpm 的摇床上培养8-12 小时，得到一级种子液；

3. 种子扩培培养基：胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，pH 值7.4-7.6；

4. 扩培合格标准：可采用分光光度计在 600nm 波长下测定菌液的OD 值，一般OD₆₀₀达到0.8-1.2 时，表明菌体浓度适宜，可以作为种子液用于后续发酵；

理化控制策略：

1. 初始 pH 设置为7.0；

2. 溶氧控制：采用有挡板的 500mL 摇瓶，以增加气液接触面积提高溶氧。在培养基中添加适量的表面活性剂（如吐温- 80）来降低发酵液表面张力，进一步促进氧气溶解，但要注意添加量不宜过多以免对菌体产生毒性；

摇床参数设计：

1. 第一阶段（0-6 小时）：温度37°C，转速180rpm。此阶段主要是菌体的快速生长繁殖期，相对较低的转速可减少菌体的剪切力损伤，同时温度适宜菌体快速增殖；

2. 第二阶段（6-12 小时）：温度37°C，转速提高到220rpm。随着菌体数量增加，对溶氧需求增大，提高转速以增加溶氧供应，满足菌体生长和少量蛋白表达的需求；

3. 第三阶段（12-24 小时）：温度降低至30°C，转速维持在220rpm。降低温度可降低菌体生长速率，减少代谢副产物积累，同时有利于重组蛋白的正确折叠和表达，在较高转速下保证溶氧持续供应以促进蛋白合成；

染菌防控：

培养基和摇瓶等器具在121℃高压灭菌30min。接种操作在超净工作台中进行，操作人员严格遵守无菌操作规程，穿戴无菌服、口罩和手套等。在发酵过程中，每天观察摇瓶内培养液的颜色、浑浊度和气味等，若发现异常（如培养液变浑浊、有异味、颜色改变等），及时停止发酵并分析染菌原因。