成药性差? 一文带你了解一种新型强效具口服VHL配体如何杀出重围！

2024-06-05

VHL蛋白是Cullin RING E3连接酶的关键底物受体蛋白。它具有广泛的组织表达，并通过识别羟基化HIF-1α转录因子，充当缺氧应激反应的关键调节因子。

PART. 01

研究背景

VHL蛋白是Cullin RING E3连接酶的关键底物受体蛋白。它具有广泛的组织表达，并通过识别羟基化HIF-1α转录因子，充当缺氧应激反应的关键调节因子。

在常氧（高氧）条件下，HIF-1α在特定脯氨酸残基处被脯氨酰羟化酶 (PHD) 羟基化。这些羟脯氨酸标记可被 VHL 有效识别，VHL是E3连接酶CRL2的底物受体。一旦HIF-1α被招募到E3连接酶中，它就会成为泛素化和随后蛋白酶体降解的目标。

图1.化合物107（GNE7599）：基于VH-021的SAR与类药性优化。

除了在调节缺氧应激反应中的作用外，VHL作为通过泛素蛋白酶体系统 (UPS) 进行靶向蛋白质降解的招募剂而引发了广泛的研究。基于VHL的异双功能降解剂（也称为PROTACS）是最常见的化合物之一。最近，一种基于VHL的BCL-XL靶向降解剂化合物DT2216进入临床研究（专利号：NCT04886622），用于治疗淋巴瘤和实体瘤。

此外，还报道了一种基于VHL的高效泛KRAS降解剂，能够降解多种KRAS突变体。虽然Cereblon (CRBN)和VHL-招募分子似乎同样适合作为降解剂，但VHL-招募降解剂可能更有效，因为在VHL-CRBN异二价降解剂的头对头比较中，CRBN被选择性降解。

然而，CBRN-招募酰亚胺配体及其衍生物具有更好的成药特性，例如口服生物利用度，从而解释了目前临床研究中对基于CRBN的异双功能降解剂的偏好。

在优化初始VHL配体方面已经做了大量的努力，许多专利证明了这一点，并在Diel等人的文章中进行了总结。第一个模拟肽的小分子VHL配体是基于与VHL/长链蛋白B/长链蛋白C (VBC)蛋白复合物结合的HIF-1α肽的共晶结构设计的。

如前所述，所有这些VHL配体目前面临的困局是效力适中、细胞渗透性低，因此口服生物利用度低，从而限制了作为口服生物可利用的基于VHL的异双功能降解剂的潜在应用。

VHL配体作为拮抗剂的广泛使用，特别是在靶向蛋白质降解剂作为招募部分的背景下，促使研究人员鉴定出具有改善的口服生物利用度的更有效的分子，以加速走进临床造福更多患者。

PART.02

研究结果

来自美国基因泰克公司的研究人员描述了一种通过在纳米生物发光共振能量转移 (nanoBRET)系统测定评估其细胞靶点参与（以表观解离常数 (KD app) 表示），对拟肽VHL配体进行全面的SAR优化（图2）。这项研究最终鉴定出了GNE7599是一种高效的皮摩尔 VHL 结合剂，具有纳至亚纳摩尔的细胞靶标结合活性以及良好的口服生物利用度。

研究人员最初从VH032支架开始，使用固相合成方法快速生成多种衍生物。为了评估细胞靶标的参与，他们在nanoBRET测定中测试了生成的化合物，以同时评估VHL结合效力（基于探针位移的KD应用程序）并估计渗透性的影响（在存在细胞透化剂(+)洋地黄皂苷或不存在 (−)洋地黄皂苷的情况下）测量。

图2.用于优化 VHL 配体的总体策略

最初，他们采用了外消旋形式的结构单元1h；然而，即使在获得更多对映体纯1h后，在固相肽合成过程中也会发生外消旋化。因此，他们决定合成一种构型稳定的变体，在C-α和苯基之间含有一个额外的碳，得到片段(R)-2-氨基-3-(4(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙酸。（图3a）

图3a:化合物 1−5 以及参考化合物 VH032 和 VH-021 的 VHL NanoBRET 表观解离常数 (KD app)，单位为 μM（± 洋地黄皂苷细胞透化）

使用d-联苯丙氨酸（dBip）用苯基取代4-甲基噻唑得到化合物5。含甲基噻唑的化合物4和含dBip的化合物5在不存在细胞透化剂的情况下，化合物5的细胞效力高出10倍以上。尽管与VH032相比，含化合物5具有较弱的结合活性，但它为固相合成提供了合适的手柄，不会外消旋，并且显示出良好的渗透性，因此被选为初始配体优化的RHS替代物。为了进一步评估dBip作为适当的RHS部分，他们获得了与VBC结合的化合物5的晶体结构（图3b）。

图3b:化合物 5 与 VHL 复合物的 X 晶体结构（PDB ID：9BJU）

晶体结构显示出与之前报道的VH032类似的结构排列。中心羟脯氨酸OH基团与S111和H115形成双齿氢键，而Hyp主链酰胺基团通过氢键与H110主链和Y98侧链相互作用。新引入的RHS dBip基团穿透由残 F76、P86、Y98、P99、R107和I109组成的疏水结合口袋，该口袋与VH032中甲基噻唑-苄基占据的口袋相同。

通过新的RHS实施，他们合成并测试了一组各种LHS和RHS衍生物。（图4a、表1−6）。

图4：(a) 每个取代库的一般化学结构； (b) KD app 小于 0.1 μM 的突出显示化合物的化学结构

最初，他们研究了RHS，重点关注R1基团取代（RHS R1，表1）。所有17种R1基团衍生物（化合物6−22）均具有中等到低效力，没有一个测试变体显示出增强的活性；因此，R1组的进一步优化被认为不太有吸引力。

表1.R₁优化RHS的VHL NanoBRET细胞靶标参与结果

接着，他们也在LHS上测试了各种替代品。包括取代LHS氨基酸上的R2基团（LHS R2-SC，表2），杂环子库取代具有不同脯氨酸衍生物的整个LHS（LHS R3-Pro，表3和S8）、没有侧链的杂芳基（LHS R3-Het，表4）以及含有侧链的杂芳基（LHS R3-Het-SC），表5）。

表4.在 LHS（R3-Het）上进行R₃优化的VHL NanoBRET细胞靶标参与结果

对于侧链替换子库LHS R2-SC（表2），他们保留了N端胺上的乙酰基，以维持与附近结构水分子的关键氢键（图3b）。

去除叔丁基侧链（化合物23）会导致活性完全丧失。 类似地，用偕二甲基 (24)、各种环烷基（化合物25−29）替换 α 氢，或安装R α-甲基 (30) 都不会产生任何结合活性。

有趣的是，通过添加高度约束和庞大的金刚烷基（如44）可显著增加效力，这可能是由于构象约束增加以及与F9和W88的疏水相互作用的协同作用。

他们还探索了连接物附着的潜在位点，因为这可能对降解物的稳定性、底物范围和功能产生巨大影响。数据表明LHS侧链β分支的存在对提高VHL结合配体的活性非常有利。此外，哌啶和青霉胺部分是连接体附着的合适出口载体，而不影响结合活性。

表2.在LHS（R2-SC）上进行R₂优化的VHL NanoBRET细胞靶标参与结果

此外，他们还通过引入各种脯氨酸衍生的脂肪族杂环来评估锁定LHS ψ扭转角的影响，这些杂环包括LHS R3Pro子库（表3），将LHS侧链连接到酰胺主链。总体而言，与之前的系列相比，活性没有显着改善。

表3.在LHS（R3-Pro）上进行R₃优化的VHL NanoBRET细胞靶标参与结果

他们接下来继续探索各种酰胺对LHS的取代：用各种芳香杂环取代键，产生子库LHS R3-Het（表4）。结果发现，只有含有65的异恶唑具有中等活性，而所有其他化合物（66−74）的KD app超出了测定极限。

根据之前对酰胺LHS R2-SC系列的研究(表2)，侧链的存在通过限制二面角对活性有重大影响。因此，他们想通过生成含有LHS R3-Het-SC(表5)子库的侧链来探索是否具有类似的积极作用。

令人欣慰的是， 引入支化的异丙基使得杂芳基系列的效价显著提高。 例如，含有异丙基侧链的异恶唑化合物79与不含侧链的相应化合物65活性差异达到了惊人的100倍。

与（表4）系列中不含侧链的化合物低活性相比，所有测试的含有侧链的杂芳基化合物（79−86，表5）具有μM至nM范围内的可测量活性。这些结果强调侧链可能通过限制围绕二面角的旋转而对活性产生非常有益的影响。

此外，异恶唑和1,2,3-三唑杂环相较匹配对33中LHS酰胺的效力提高约10倍，可以作为合适的LHS酰胺生物等排体，。

表5.在LHS（R3-Het-SC）上进行R₃优化的VHL NanoBRET细胞靶标参与结果

虽然含有异恶唑和三唑的化合物79和83的KD值相同，均为0.16 μM，但他们选择了三唑进行进一步的SAR探索，因为它可与各种侧链组合和环功能化，从而得到LHS R3-三唑系列(表6)。

此外，1,2,3-三唑被认为在酸性或碱性条件下水解、代谢降解和氧化还原条件下是稳定的，而异恶唑通常也被认为是稳定的，但已被证明偶尔会受到还原性开环或醛氧化酶代谢的影响。

表6.LHS上R₃优化（R3-曲唑）的VHL NanoBRET细胞靶标参与结果

值得注意的是，与含三唑的化合物88相比，含非三唑叠氮化物的化合物87的活性低100倍，从而凸显了芳环的关键影响。从三唑4位延伸，通过与R69的脂肪族部分和Y112的侧链相互作用，潜在地获得一些额外的效力。

有趣的是，环丙基（化合物90）的加入导致活性增加了2倍，他们还探索了三唑4位上的各种其他的各种额外的出口载体偶联。所有这些化合物具有相似的活性范围，变化幅度在3倍以内。值得注意的是，含有4-甲氧基甲基的化合物93 (KD app±洋地黄苷:0.11/0.16 μM)具有相似的活性，可能更适合于更高的细胞通透性以及未来出口载体设计。

总体而言， 测试各种LHS取代导致鉴定出具有β支化侧链的4-环丙基三唑部分是最有效的片段，其KD app值在亚μM范围内。

优化LHS部分后，他们将重点转移回RHS。最初，他们使用dBip部分作为RHS替代物，以实现高效的化合物合成；然而，如前所述，含有dBip的化合物5的活性要弱得多。

因此，他们将替代物替换回甲基噻唑苯甲胺母体部分，并评估优化的LHS的组合是否与原始RHS兼容，从而得到化合物104。正如预期的那样，化合物 104显示出显著的效力改善，KD app为6.5 nM（图5a）。

图5a：与VHL复合的含4-环丙基-三唑的化合物104的晶体结构(PDB ID：9BOL)。红色虚线代表氢键相互作用，黄色虚线代表范德华相互作用，橙色虚线代表π−π相互作用

化合物104与含有dbip的化合物90相比，活性增加了10倍。为了阐明这种增强效价的结构细节，他们以1.99 Å分辨率解析了化合物104与VHL:Elongin B:Elongin C (VBC)复合物结合的共晶结构。

从图5a可以看出，104的LHS部分与VHL形成了几个关键的相互作用。三唑环相对于酰胺羰基呈反构象，位置3的氮与关键结构水分子形成氢键，通过氢键与残基N67和H115保持在原位，其他VHL结构中也发现了这种情况。

更重要的是，三唑与Y112的侧链形成π−π堆叠相互作用。额外的4-环丙基取代指向R69侧链，与R69侧链的脂肪族部分发生疏水相互作用。104的中心Hyp和RHS表现出与先前在VH032中报道的相同类型的相互作用。

总的来说，三唑与Y112之间良好的π−π相互作用以及4-环丙基与R69之间额外的疏水相互作用可能解释了化合物104相比较含有5的LHS酰胺和参考化合物VH032更高效。

为了进一步提高活性，他们研究了RHS的扭转角，并意识到二面角，特别是ψ扭转角，即使在引入甲基后，仍然存在多种分子构象（105）。为了进一步限制化合物的束缚态，他们通过引入环状系链来消除围绕 ψ 角的旋转。

令人欣喜的是，化合物107(GNE7599) 具有非常高的效力，在存在和不存在洋地黄皂苷的情况下，在nanoBRET测定中达到<2.5 nM 的KD app限值以下（图5b）。为了进一步估计这种高活性化合物的效力，他们改用基于SPR的结合测定，并获得了107(GNE7599)的KD为540 pM。这使得107(GNE7599)成为迄今为止描述的最有效的VHL配体，也是第一个达到皮摩尔结合范围的VHL配体。

根据MDCK测定，化合物107 (GNE7599)的细胞通透性提高了>10倍，并且水溶性为190μM。此外，107(GNE7599)在肝微粒体和肝细胞中显示出高血浆蛋白结合性和中等稳定性。

获得体外数据后，他们评估了先导化合物107(GNE7599) 和参考化合物VH021在小鼠单剂量研究中的体内药代动力学特性（1.0 mg/kg IV和10.0 mg/kg PO）。有趣的是，107(GNE7599)的血浆清除率低4倍（107 (GNE7599)，而分布容积 (Vss) 相对不变。

最引人注目的是，107(GNE7599) (F=46.5%) 的口服生物利用度显着提高，与VH-021(F=2.7%) 相比提高约17倍。 107 (GNE7599) 良好的口服生物利用度凸显了 VHL 配体发现工作的一个重要里程碑，而此前这些工作一直因低口服生物利用度而受到阻碍。

化合物107(GNE7599)尽管具有高亲脂性，但仍显示出高水溶性，以及良好的体内稳定性和高细胞渗透性。这些属性都适合在降解剂环境中应用。在未来的研究中，评估所提出的VHL配体在二价降解剂中的效用将会是一个很有价值的研究方向,或将引起一股新的研发热潮！

编者按：

GNE7599作为高效的皮摩尔VHL结合剂，具有纳至亚纳摩尔的细胞靶标结合活性以及良好的口服生物利用度。这一发现克服了之前VHL配体面临的效力适中、细胞渗透性低、口服生物利用度低等难题，为基于VHL的异双功能降解剂的研发开辟了新的道路，有望在临床治疗中发挥重要作用。

参考文献（可上下滑动）：

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撰稿人 | 夕阳涂鸦药渡

责任编辑 | 邵丽竹

审核人 | 何发

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