腺相关病毒 (AAV) 是一种领先的基因治疗载体，预计将在未来十年内治疗多种疾病。FDA 已批准三种 AAV 疗法用于治疗 Leber 先天性黑蒙、脊髓性肌萎缩症和 B 型血友病（截止2023年1月）。然而，这些疗法的费用分别约为 85 万美元、210 万美元和 350 万美元。这样的价格限制了 AAV 基因疗法的广泛适用性，并使大多数患者无法接受。这个问题很大程度上源于 AAV 的高昂生产成本。与此同时，合成生物学领域发展迅速，并显示出解决生物生产问题的特殊能力。在这里，我们讨论了应用合成生物学设计来降低 AAV 生产价格的新兴工作，我们认为这些工作可以在使基因治疗更广泛的可获得性方面发挥重要作用。

作为一项新兴技术，基因疗法带来了许多令人兴奋的可能性：治愈遗传疾病、溶解肿瘤、治疗神经退行性疾病、延长健康寿命、甚至帮助宇航员更好地在火星上长期生存。AAV 载体因其最小的免疫原性、组织选择性血清型、衣壳修饰的适应性以及临床成功而代表了最重要的基因治疗递送技术之一。近年来，FDA 批准了三种 AAV 基因疗法（截止2023年1月）：用于治疗莱伯先天性黑蒙的 Luxturna、用于治疗脊髓性肌萎缩症的 Zolgensma 以及用于治疗 B 型血友病的 Hemgenix。然而，这些所谓的奇迹疗法代表了一些世界上最昂贵的疗法，标价分别约为 85 万美元、210 万美元和 350 万美元。高昂的价格在很大程度上源于生产重组 AAV 所面临的挑战。因此，迫切需要新的生产创新，以便基因疗法能够发挥其潜力。合成生物学是一个快速发展的领域，采用合理的生物学设计方法，开始解决 AAV 生产的困难。在这篇综述中，我们将讨论应用合成生物学设计策略来开发负担得起的 AAV 生产管线的进展，并探讨这些方法最终如何发展，以使世界各地的人们更容易获得基因治疗。

建立AAV生产方法

AAV生产大致可分为上游工艺和下游工艺。上游工艺通常涉及质粒的设计和制备、生产细胞的扩增、细胞的转染以及细胞内 AAV 的合成。下游工艺通常涉及 AAV 纯化、质量控制措施以及采取措施准备最终的临床制剂。由于这一过程的复杂性和所涉及生物学的复杂性以及对临床级方案的需求，AAV 的生产成本仍然非常昂贵。

在小型实验室规模中，生产重组 AAV 的流行工作流程是对哺乳动物细胞进行三质粒转染，然后进行基于超速离心的纯化（图 1A）。探索这种小规模的管线将作为一个有用的起点，可以与工业规模的方法进行比较。对于三质粒转染方法，将三种质粒转染到哺乳动物细胞中：转移质粒、Rep-Cap质粒和辅助质粒。转移质粒包括将被包装到 AAV 衣壳中的 DNA 以及形成反向末端重复序列 (ITR) 的侧翼序列。当 DNA 处于单链形式时，这些 ITR 折叠成二级结构，有助于促进 AAV 复制和基因组包装。Rep-Cap 质粒编码复制蛋白 Rep78、Rep68、Rep52、Rep40 以及衣壳蛋白 VP1、VP2 和 VP3 以及辅助蛋白 MAAP 和 AAP。辅助质粒编码腺病毒基因 E4、E2a 和 VA。另外两个腺病毒辅助基因 E1a 和 E1b 通常在哺乳动物细胞基因组中的位点表达。应该指出的是，一些研究人员已将 Rep-Cap 和辅助质粒组合成一个构建体，以实现二质粒转染工艺，尽管这种方法不太常见。转染几天后，可以通过裂解哺乳动物细胞并沉淀细胞碎片来释放重组 AAV。接下来，通过 CsCl 密度梯度或碘克沙醇不连续梯度对裂解液进行超速离心。然后可以收集含有纯化 AAV 的馏分。为了去除 CsCl 或碘克沙醇，需要进行缓冲液置换洗滤过程。在临床前实验室中，这些步骤通常足以获得所需的重组 AAV。

图 1. AAV 生产面临的挑战。(A) 小型实验室规模 AAV 生产的工作流程。(B) 临床规模 AAV 生产上游工艺的一些困难。贴壁细胞由于在表面生长而无法放大。相比之下，悬浮细胞在 3D 环境中生长，因此代表了一种更具可放大性的方法，但正确转染它们具有挑战性，且开发有效的悬浮细胞系并非易事。(C) 临床规模的 AAV 生产下游工艺中的一些困难。机械细胞裂解可能通过 AAV 聚集造成损失，而化学细胞裂解会引入有毒污染物。基于层析的纯化方法比超速离心更具可放大性，但这些方法具有某些缺点。亲和层析无法将空衣壳与完整衣壳分开。离子交换层析可以去除一些空衣壳，但由于特异性差和需要极端 pH 条件，也会损失许多完整的衣壳。

大规模临床 AAV 生产涉及上游工艺的许多困难，这些困难通常不会发生在临床前阶段（图 1B）。由于 AAV 质粒必须首先在大规模大肠杆菌发酵中进行 GMP 级生产，因此处理质粒产量和纯度的批次间差异是一项挑战。贴壁哺乳动物细胞的扩增也会引入变异性，因为很难确保平行培养容器中 pH 值和氧浓度等参数的足够一致性。培养基中的动物血清可能携带外来物质，必须在后续步骤中将其除去。在处理许多含有贴壁细胞的容器时，哺乳动物细胞培养的污染风险也是一个主要问题。虽然特殊类型的生物反应器（例如 iCELLis 系列的生物反应器）可以用来代替数百个较小的贴壁培养容器，但这些系统的 AAV 总体生产能力仍然有限。由于这些因素，放大贴壁细胞培养规模仍然具有挑战性且昂贵。基于悬浮的细胞培养代表了一种更具规模放大潜力的替代方案，因为体积尺寸的增加速度比表面积的增加速度快得多。然而，开发在悬浮系统中有效合成 AAV 的细胞系很困难，与贴壁培养物相比，悬浮培养中的单位体积细胞密度通常较低，并且悬浮细胞的三质粒转染通常会导致细胞吸收不同质粒的非最佳比例。后者可能会增加空衣壳（缺乏 DNA）或产生的其它有缺陷的 AAV 的比例。在这种情况下，一个可能有用的策略涉及开发表达 AAV 复制和包装蛋白的细胞系，尽管 AAV Rep 蛋白的毒性使这变得复杂，导致需要基因调控策略来防止组成型表达。从化学角度来看，三质粒转染步骤在临床规模上涉及更多困难。磷酸钙转染通常会导致批次间的差异，因为其功效对 pH 值和杂质敏感。脂质体转染效率高、细胞毒性低，但需要昂贵得多的试剂。聚乙烯亚胺是另一种常用的转染试剂，但它对 pH 值敏感且具有细胞毒性。临床 AAV 生产的上游工艺显然需要改进。

大规模临床 AAV 生产还涉及下游工艺的挑战，这些挑战通常不会发生在临床前阶段（图 1C）。细胞裂解对于提高 AAV 产量是必要的，因为生产细胞不能释放足够的病毒颗粒。但机械裂解方法会引发 AAV 聚集，而使用 Triton X-100 和类似去污剂进行的化学裂解已被证明会对患者产生高毒性。Triton X-100 于 2016 年被欧洲化学品管理局标记为高度关注物质，日益严格的监管阻碍了其在 AAV 疗法中的使用。裂解后去除细胞碎片的过滤也会带来复杂性，因为过滤器经常堵塞，并且很难针对特定 AAV 血清型以可放大的方式优化过滤器。对于 AAV 纯化，虽然 CsCl 或碘克沙醇超速离心在小型实验室规模下很有用，但超速离心很难扩大到更大批次的临床生产。柱层析纯化方法被认为是一种更具规模放大潜力的解决方案，但许多方法都受到限制，因为它们无法区分完整衣壳和空衣壳。例外的是，某些离子交换层析方法能够去除一些空衣壳，尽管它们采用可能损坏 AAV 的极端 pH 条件，并且它们通常会牺牲许多完整的衣壳。此外，必须根据给定 AAV 血清型的特性来优化层析工作流程。临床 AAV 生产迫切需要更好的下游工艺方法。

合成生物学采用合理设计方法

合成生物学是一门利用设计思维创建新生物系统的学科。合成生物学家从电气工程框图中汲取灵感，在概念上将生物系统分解为大致模块化的部分（基因、调控序列、启动子、蛋白质结构域、遗传回路、核糖开关等），并将这些部分安装到细胞“底物”中，例如大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞。然后对这些部件进行测试，看看它们是否可以在这样的正交背景环境中运行，从而实现可再现的功能结果。生物部分经常通过定向进化和计算方法进行优化。此外，合成生物学经常利用人工 DNA 合成、Gibson组装、CRISPR、计算机辅助设计软件、机器学习和实验室自动化等当代工具。最后，该领域的特点是强调快速设计-测试-构建-学习周期。这些策略说明了合成生物学设计新生物系统的方法。

在过去的十年中，合成生物学已经从一个新兴领域发展成为一个蓬勃发展的产业。它引入了一些进步，例如寻找并摧毁肿瘤的工程化 T 细胞、控制神经元活动的基因编码光诱导离子通道、以及充当肥料以增加作物产量的设计细菌。生物生产代表了合成生物学已表现出特定水平的能力的领域。如前所述，合成生物学的一个关键策略是跨物种转移有用的分子机制，以便在正交宿主细胞内实现可重复的结果，这些结果对所讨论的过程具有有益的特性。许多成功的合成生物学公司（例如，Ginkgo Bioworks、Zymergen、Amyris、Impossible Foods 等）专门利用此类策略来设计生物体，以可持续的方式，合成染料、织物、食品、电子材料、药品和化妆品等产品。这些商业成功案例说明了合成生物学作为一种生产方法的力量。

合成生物学作为生物生产方法的优势在于其创造性地组织系统的能力，这些系统对纳米级发生的过程进行可重复的控制。Eric Drexler 对纳米技术的基本愿景集中在创建合成分子机器的想法上，这种机器可以逐个原子地组装任何所需的结构（图 2A）。然而，生物世界中已经存在类似强大的分子机器，将分子生产问题转化为逆向工程的练习（图 2B）。合成生物学的设计导向思维可以说在实现Drexler关于纳米技术的一些建议方面取得了重大进展。我们认为合成生物学设计代表了组装 AAV 复杂大分子结构的一种有前途的策略。

图 2. 非生物纳米技术和合成生物学作为复杂分子生产方式的比较。(A) 假设的基于纳米技术的分子组装机，它可能采用光学可编程的“行走”分子将催化剂移动到所需的位置，从而以精确的方式将原子连接在一起。尽管这种组装机代表了一种广泛的革命性生产机器，但开发和扩展如此复杂的技术可能需要几十年的时间。分子组装器的现有示例并不像此处所示的假设那样广泛适用。(B) 使用合成生物学可以更容易地实现与纳米技术相关的许多目标，特别是在寻找生物分子产品时。通过对细胞中已有的分子机器进行逆向工程，可以构建新的生物系统，从而促进生产目标。合成生物学的另一个主要优点是它采用自我复制系统，这通常可以简化所需产品的可放大生产。相比之下，生产非生物纳米技术（不能自我复制）通常需要具有挑战性的合成过程，特别是对于复杂的纳米器件。

原文：L.T.Collins, S.Ponnazhagan, D.T.Curiel, Synthetic Biology Design as a Paradigm Shift toward Manufacturing Affordable Adeno-Associated Virus Gene Therapies. ACS Synthetic Biology, 2023.

撰稿人 | 生物工艺与技术

责任编辑 | 邵丽竹

审核人 | 何发