临床管线甚至商业产品组合开始以广泛的非抗体蛋白和片段以及传统抗体产品的变体为特色：例如，单链可变片段（scFv）、片段抗原结合（Fab）产品和单域-抗体片段（也称为纳米抗体）。通过探索此类形式，药物开发商希望继续利用蛋白质结合的功效优势，同时克服与 MAb 制造相关的关键技术和经济障碍。Simeon 和 Chen 指出，一个主要问题是 MAb 通常需要哺乳动物（通常是鼠类）表达系统来执行正确的翻译后修饰，包括糖基化。此类宿主需要复杂的生产过程，需要昂贵的耗材，从而产生高昂的成本，而这些成本又转嫁给了患者。相比之下，非 MAb 蛋白可能不需要糖基化，从而能够使用需要更便宜材料和更简单生产工艺的微生物和其它表达系统。与 MAb 相比，替代性蛋白质生物制品还可以表现出更高的热稳定性和更强的抗化学降解性。

然而，非 MAb 蛋白的下游纯化仍存在问题。从弗吉尼亚大学化学工程助理教授 Nick Vecchiarello 那里了解到，行业标准的 Protein A 层析填料不适合缺乏可结晶片段 (Fc) 区域的蛋白质和抗体片段。因此，新兴的蛋白质生物制品将需要新颖的分离技术。Vecchiarello 实验室设计肽功能化基质，以提高对层析填料与治疗性蛋白质相互作用的科学理解。在 2023 年 2 月举行的 BPI West 会议暨展览以及 2023 年 5 月举行的 BPI 欧洲活动中，Vecchiarello 探讨了使用混合模式层析填料改进非 MAb 纯化的机会。他还描述了他的团队在对候选填料进行高通量筛选方面所做的努力。在此过程中，该小组希望开发全面的配体库，可用于促进选择最佳的复合模式填料组。在 Vecchiarello 进行 BPI Europe 演讲之前，记者与 Vecchiarello 进行了交谈，以了解更多有关非 MAb 疗法的独特纯化要求以及混合模式填料的潜在优势的信息。

Vecchiarello 在伦斯勒理工学院师从 Steven Cramer 博士学习期间获得了化学和生物工程博士学位。在 2023 年 1 月加入弗吉尼亚大学之前，他曾在位于马萨诸塞州剑桥市的安进公司担任纯化科学家，并在麻省理工学院化学系担任博士后研究员。

需要新颖的分离

为什么非 MAb 蛋白疗法比 MAb 对应物更难纯化？

我们可以从几个角度来思考这个复杂性。首先要考虑的是标准的 Protein A 亲和层析填料无法纯化缺乏 Fc 区的治疗性蛋白。因此，现成的 Protein A 选项不适合非 MAb 产品。由于这一限制，您还需要认真考虑产品的杂质概况，包括其宿主细胞蛋白 (HCP) 含量。Protein A 步骤可以很好地将 HCP 水平降低到百万分之几百 (ppm)。但传统的离子交换 (IEX) 或疏水相互作用 (HIC) 层析步骤通常无法实现这种特异性，因此这些杂质可能会被带入下一步。

在这种情况下，您不仅必须考虑给定步骤如何运行，还必须考虑步骤如何配对。这个因素带来了额外的工作，但也带来了机会。例如，您可以确定两个步骤来去除不重叠的杂质组，这样，这些步骤比单个 Protein A 步骤更有效地纯化您的产品。在分离科学中，我们称之为正交原理。

另一个考虑因素是 MAb 往往具有较高的等电点（pI 值），而中国仓鼠卵巢 (CHO) 和其它哺乳动物细胞培养过程中产生的 HCP 往往呈酸性。通常，下游科学家可以在层析步骤中利用生物物理特性的这种差异。非 MAb 产品的 pI 和 pH 值往往表现出较小的差异，从而使分离过程变得复杂。

还要考虑到并非所有治疗蛋白都是在哺乳动物表达系统中产生的。我们的团队经常与麻省理工学院 (MIT) 的 J. Christopher Love 实验室合作，开发用于毕赤酵母表达蛋白质的层析填料。尽管毕赤酵母具有出色的杂质谱，但它产生的 HCP 与 CHO 和其它哺乳动物宿主产生的 HCP 显著不同。理解和探究非 MAb 产品和标准 MAb 之间的差异可能很困难。

最后一个考虑因素是生物制药公司拥有首选的抗体纯化平台。这些技术对许多单克隆抗体都很有用。但非 MAb 疗法通常缺乏实现最佳纯化的平台工艺，因此，此类产品的开发人员需要使用不同的填料，甚至可能在其材料中添加液相改性剂。离开平台可能会使工艺变得复杂。

您在 BPI West 和 BPI Europe 的演讲重点关注混合模式层析填料为非 MAb 纯化带来的机会。正交性是使用复合模式填料的主要优点吗？

混合模式填料的开发人员并未声称发明了正交分离的概念。多年来，科学家一直认为 HIC 和 IEX 是正交方法，因为它们以不同的方式与样品材料相互作用。复合模式填料不会在一个工艺中充当离子交换剂，然后在另一个工艺中充当 HIC 填料。相反，它们呈现出协同相互作用的电荷和疏水性的组合。这种协同作用通常很难理解。

好消息是，复合模式填料通过创建有趣的选择性“窗口”来实现新颖的纯化策略。由于填料具有高耐盐性，因此它们还能够从细胞培养液中捕获蛋白质，而使用离子交换剂可能需要稀释进料以实现低电导率或降低离子交换的强度。

由于复合模式填料仍然没有被很好地理解，科学家们经常回避使用它们。您不能进入复合模式分离思维，“这是我的蛋白质，这是我的填料。我清楚地知道我将如何操作这个过程。”这种填料工作良好，但有时不直观，而且由于筛选窗口与传统填料不同，因此定义填料和工艺的稳健性更加困难。

还有哪些其它因素导致混合模式交互难以预测？

蛋白质是具有许多不同电荷和疏水性“斑块”的结构。一个斑块可能是疏水性的，而相邻的一个斑块可能是亲水性的。因此，“斑块”大小、电荷、疏水性和位置是重要因素，所有这些都可能在不同的工艺条件下发生变化。在存在产品变体的情况下，复合模式填料的工作方式也可能不同。蛋白质突变可以改变配体的方向，从而改变它们的结合行为。

请记住，蛋白质-配体结合是一个高度动态的过程。我们倾向于认为蛋白质是稳定的三维结构。但它们并不是静态的；它们的构象分布广泛。因此，了解复合模式填料相互作用非常复杂。您可能会想，“我知道这些配体将如何与我的目标蛋白相互作用”，但实际上，分离结果将代表相互作用的集合。产物蛋白可以在 100 个不同的位置与混合模式配体相互作用，所有这些位置都具有不同的结合强度。也就是说，如果您能够确定正确的操作条件，复合模式填料可以提供优于传统填料化学物质的优势，尤其是对于非 MAb 蛋白质。

填料开发与筛选

您的实验室如何筛选不同的复合模式填料？

我们采用实验和计算方法。我们当前的目标是研究不同复合模式填料的正交使用。许多此类填料可在市场上买到，分离科学家已将它们用于各种应用。但很少有人同时应用它们。通常，只有一种复合模式填料被集成到一个工艺过程中，可能作为蛋白质 A 捕获后的精纯步骤。但同样，使用 Protein A 可能不是非 MAb 蛋白和新兴疗法的最佳方法。因此，我们正在采取系统的方法进行填料筛选，利用组合化学来设计大型复合模式填料库。

首先，我们将一组氨基酸或其它小分子功能化到填料基球表面。这可以通过相对较高的吞吐量来完成，因此我们有数百种复合模式填料可以根据严格控制的参数进行分类和测试。我们主要在将配体附着到填料基球表面时应用组合化学方法。然后，我们可以研究配体的电荷和疏水基团，并确定这些基团与产物蛋白质的接近性、灵活性和可接近性。我们还可以研究不同配体密度的特性。可以使用多种策略来表征给定的蛋白质溶液如何与我们的填料库中的材料相互作用。例如，我们可以进行生物物理和热力学表征。

我们试图在填料开发和初步筛选过程中探索广阔的“化学空间”。因为存在如此多的可能性，我们的目标是想出一些方法，让我们能够快速且以最少的实验工作来理解蛋白质如何与许多复合模式填料相互作用。这些早期实验构成了我们工作的计算部分的基础。高通量实验的数据帮助我们生成“杂质指纹”，记录测试的产品蛋白质如何与填料相互作用。如果我们能够理解蛋白质如何与一种复合模式填料相互作用 - 例如，它们结合的强度、配体的微小修饰如何改变这种相互作用，以及这种相互作用在填料之间有何不同 - 那么我们就可以开始考虑配对复合模式填料，以改善纯化过程。分析所有可能的填料配对的综合列表有助于确定可有效纯化各种生物产品（包括非 MAb 蛋白质）的填料组合。“白日梦”是找到一套最小的复合模式层析填料，可以作为纯化非 MAb 蛋白质产品的通用平台。因此，我们的工作不是开发一个平台本身，而是开发一种可平台化的方法。

在填料筛选和选择过程中，哪些特性最需要评估？

我们的方法很灵活，部分原因是可以考虑很多特征。显然，您希望填料具有良好的稳定性和寿命。这些不一定是我们在流程中检查的第一个参数，但一旦您找到有前途的候选填料，您将需要验证这些因素。您还必须确保产品蛋白质可以从给定的填料中洗脱；显然，如果填料不可逆地与您的治疗药物结合，则填料将不起作用。因此，早期筛选涉及检查和平衡，以确定哪些填料将或不会与给定蛋白质结合。

考虑到我们在实验室进行的筛选类型，我们首要考虑的是正交选择性。想象一下将混合模式配体固定到层析填料上，然后将治疗性蛋白质产品加载到柱上并以结合-洗脱模式运行。一部分 HCP 和其它杂质已从目标蛋白中去除，但另一部分已与它们共洗脱。我们的筛选方法旨在快速确定如果我们用另一种（甚至可能是第三种）复合模式填料纯化该材料会发生什么。例如，第二种填料是否会去除最初与产品共洗脱的杂质，或者两种填料要纯化的 HCP 是否存在显著重叠？如果您需要串联使用三种填料，什么顺序可以去除最多的杂质？我们可以使用我们开发的软件进行一些计算机评估。在回答了基本问题后，我们可以通过考虑邻近因素来完善我们的结果 - 例如，使用具有最高耐盐性的填料开始纯化是否有意义。

方法和设备

您的实验室使用哪些分析方法？您的技术要求是什么？

根据我们需要分析的特性，我们有多种分析选项。为了筛选纯组分蛋白质和给定混合模式配体之间的相互作用，使用标准 96 孔板读数器进行紫外 (UV) 分光光度测定通常就足够了。首先，我们将特定体积的填料加样到每个孔中，然后使用自动肽合成仪和组合化学原理对填料上的短肽进行功能化，以便每个孔包含不同的配体。然后，可以加载蛋白质产品，并监测质量平衡以了解蛋白质的结合行为。对于蛋白质混合物和复杂的情况，我们需要更详细地了解什么与配体结合或不结合，我们应用超高效液相层析 (UPLC)。

在设备方面，我们实验室的能力正在不断扩大。我们有我提到的自动肽合成仪。理想情况下，我们希望直接在 96 孔板中执行合成步骤，然后使用机器人系统执行测试。因此，我们正在尝试采购一个自动化液体处理系统，这将显著提高我们的实验吞吐量。在计算方面，我们拥有我之前提到的软件以及机械建模功能，以便我们可以应用第一原理来预测蛋白质配体行为。

将来的某个时候，如果能够对样品进行完整的蛋白质组分析，那么我们就可以描述与特定表达系统相关的所有 HCP 如何与一组给定的混合模式填料相互作用。考虑到 CHO 细胞系（目前）已知可产生约 6,000 种类型的 HCP。现在，诸如 AlphaFold 数据库（来自欧洲分子生物学实验室的欧洲生物信息学研究所，EMBL-EBI）之类的程序可以帮助我们可视化和理解三维蛋白质结构，也许我们可以将这些特性与混合模式层析填料的特性联系起来。当然，这种前景还很遥远，但这是我们的长期目标之一。

混合模式填料的新领域

您在 BPI West 和 BPI Europe 的演讲强调了您的团队对商用混合模式填料的分析。这些分析仅代表您工作的第一阶段吗？

是的，我们的研究仍然是探索性的。使用我们在实验室合成的市售填料和材料，我们仍在尝试连接混合模式配体的特性和结合行为。首先，我们正在研究短肽。这样做的优点之一是我们不受 20 种天然氨基酸的限制。我们可以通过探索具有有趣化学特征和行为的非天然氨基酸来扩展我们的化学空间。使用此类新颖材料也可能有助于我们识别具有更高稳定性和寿命的填料。层析填料在纯化过程中会暴露于蛋白酶和其它有害分子，因此我们希望识别具有长寿命的填料。这些早期分析将有助于为我们的填料开发“做好准备”，这样我们就不需要在探索的后期阶段为有希望的候选者设计更高的稳定性。

我们当前的项目正在扩大我在 BPI West 和 BPI Europe 上展示的工作范围。除了考虑市售填料外，我们还在评估我们正在开发的数百种新填料，以了解我们的材料是否可以改进当前的纯化可能性。我们正在“团体环境”中开发填料，而不是设计独立的产品。许多科学家以这种方式进行填料设计，希望开发出一种能够有效纯化某些蛋白质的填料。但很少有人考虑他们是否可以设计出彼此完美搭配或与当前可用选项完美搭配的填料。

您认为分离科学家还需要什么来改进填料开发和筛选，特别是对于非 MAb 治疗性蛋白质？

科学家需要知道从哪里开始他们的研究；可用的填料选择数量可能令人眼花缭乱。也就是说，一些障碍阻碍了填料替代品的开发。从监管的角度来看，证明新填料（或一组填料）的有效性非常耗时。缩小新填料监管审查的窗口可能有助于加快下游开发并提高尝试新纯化策略的意愿。

用于非 MAb 蛋白的填料也往往具有较宽的操作窗口，科学家通常没有以前程序的先验知识来帮助他们了解稳健性窗口。例如，您的纯化工艺可能存在操作“悬崖”，pH 值比典型条件增加 0.2 个单位会导致产品大量损失、HCP 水平激增和/或产品变体分离减少。特别是对于非 MAb 蛋白质的纯化，分离科学家将从复合模式填料中受益匪浅，这种填料在各种条件下都表现得更加稳健。

另一个考虑因素是下游团队在尝试实施非标准填料时可能难以跟上快速的开发时间表。我相信，组织将从知识“包”或数据集合中受益，这些知识“包”或数据集合将在使用具有新颖化学成分的填料时提供初步指导。公司当然会积累自己的先验知识，但大部分信息是关于 MAb 纯化和 Protein A 填料的。即便如此，先前的知识可能只代表了少数 MAb 产品的经验。对于新兴填料产品可能不存在先验知识。关于蛋白质与复合模式填料相互作用的启发可能是强大的资源。

您的实验室正在考虑哪些其它机会，以及分离科学家可以探索哪些进步？

考虑因素之一是工艺经济性。我们的实验室正在筛选不同的复合模式填料，不仅是为了识别正交有利的配对，也是为了寻找具有减少下游瓶颈特性的材料。

我知道，出于同样的原因，许多研究人员正在探索正面置换层析法，这是一种二元分离方法，其中将样品进料连续施加到层析柱上，以便样品成分按照对填料的亲和力递减的顺序相互置换。该技术可实现显著的产品上样量，从而提高产量。该领域出现了许多填料设计机会，特别是对于复合模式材料，科学家们仍在试图了解是什么驱动了强大的正面层析操作。

尽管我们目前的努力是针对制备层析应用，但我们相信我们的方法也将适用于分析。例如，我们将探索将复合模式配体功能化为高性能液相层析 (HPLC) 支持的方法，以改进在线过程分析，特别是在标准 HPLC 材料不可行的情况下。我们还正在评估如何将肽功能化到二氧化硅 HPLC 支持物上，以帮助开发确定复合模式填料的操作范围和稳健性体系的技术。

随着更多非 MAb 生物制品的出现 - 当然是针对治疗性蛋白质，也针对基因疗法和其它此类方式 - 开发超越Protein A 亲和力的纯化策略的机会将不断出现。

原文：B.Gazalille, N.Vecchiarello, Demystifying Mixed-Mode Chromatography Resins: Emerging Applications for Purification of Non-MAb Protein Therapeutics. Bioprocess International, 2023.

撰稿人 | 开朗的豌豆射手 生物工艺与技术

责任编辑 | 胡静

审核人 | 何发