文章通过分析多种常见细胞与基因治疗产品（CGT）生产工艺的不同要求，提出不同的工艺平面设计方案，重点探讨不同功能模块的分区、人、物流线的规划以及主要生产配套设施的平面规划设计方案。

近些年，细胞与基因治疗产品在制备工艺方面，由于种类的多样性与所采取工艺的差异性，且仍处于快速迭代的时期，目前尚无较为通行的、统一的制造工艺，需要灵活的生产工艺平面和配套设施，以支持不同的工艺流程，因此，产品和载体制造需标准化和规模化。正是由于近年来细胞治疗产品在我国逐步从产品研发阶段进入到商业化生产阶段，2023《GMP指南》第二版《无菌制剂》分册[1]新增了这部分内容，为这类产品的 GMP 生产实施提供了一些指导。

Part.01产品定义

传统药物往往作用于蛋白，而基因治疗则直接作用于 DNA，在根源上治疗疾病。根据作用类型的不同，细胞与基因治疗（CGT）主要分为两大类——体内治疗和体外治疗 ：体外治疗的代表为细胞疗法 ；体内治疗的代表为基因疗法。

细胞治疗是指应用人自体或异体来源的细胞经体外操作后输入（或植入）人体，用于疾病治疗的过程。体外操作包括但不限于分离、纯化、培养、扩增、活化、细胞（系）的建立、冻存复苏等。细胞治疗主要可分为免疫细胞治疗、干细胞治疗和其他体细胞治疗。

基因治疗产品通常由含有工程化基因构建体的载体或递送系统组成，其活性成分可为 DNA、RNA、基因改造的病毒、细菌或细胞等。根据基因载体类型的特性差异，基因治疗产品主要可分为以病毒为载体的基因治疗产品、以质粒 DNA 为载体的基因治疗产品、RNA 类基因治疗产品，以及以细菌微生物为载体的基因治疗产品，其中以病毒和质粒 DNA 为载体的基因治疗产品较为常见。

Part.02生产工艺分析

细胞与基因治疗产品生产，包括质粒、病毒、细胞，病毒、质粒同为载体，将目的序列递送到靶细胞内部。质粒 DNA 所搭载的目的序列是 DNA，DNA 通常需要进入细胞核才能行使相应的功能，病毒载体搭载的序列可以是 DNA，也可以是 RNA，而RNA 序列通常不需要入核行使功能，并且如果是进行宿主基因组的同源重组，病毒载体效率更高。质粒通常是在原核细胞内进行扩增后提纯，病毒载体通常在真核细胞内包装后逐步扩大培养后裂解细胞 / 收集上清后提纯获得。质粒通常稳定性非常好，对温度不敏感，病毒不一样，一般需要低温冷冻保存，对温度很敏感，反复冻融对活力影响也非常大。一般生产制造基地以从事质粒、病毒生产为主，而“细胞药”经不起长途颠簸和长时间冷冻，要求以最短流程、最快速度为患者提供个体化精准治疗。不管是医院还是药企都希望能缩短彼此之间的距离，因此，未来将催生‘前院后厂’的新模式。细胞与基因治疗产品典型生产流程图如下图 1，包括质粒生产、病毒载体生产及细胞治疗产品生产三条典型生产工艺流程。

图 1 细胞与基因治疗产品典型生产流程图[1]

2.1 质粒生产

如图 1 所示，质粒生产可分为上游（生产）工艺和下游（纯化）工艺，上游生产包括质粒构建及细菌转染，将构建好的质粒 DNA 转化到工程菌（如大肠埃希菌）建立主细胞库和工作细胞库，冻存的菌种在接种间内进行复苏，然后进行发酵培养扩增、离心裂解收获 ；下游进行各种纯化、最后除菌过滤分装保存。质粒可以扩散到空气中，不容易降解，空间熏蒸不能破坏质粒，可能会带入到产品中扩增。 在质粒的生产过程中建议尽可能使用密闭系统，避免质粒的暴露和泄漏，在不可避免的敞口操作中，应使用生物安全柜进行保护[1]。根据药品生产质量管理规范 -细胞治疗产品生产操作示例表，如表 1 [2]所示，建议质粒生产区洁净环境设置如下 ：种子复苏在 C+A 环境下操作，其余上游区操作均在密闭罐中发酵，因此，在产品纯化之前都可以在 D 级环境下生产，直至深层过滤后，进入纯化阶段开始要求在C级环境下操作。另因上游操作区可能涉及活菌体，故上游区需考虑所有废固、废液灭活处理后送出。质粒生产功能区及洁净区划分以及关键物料走向，如图 2 所示。

表 1 生产操作环境洁净度级别参照示例表

注 ：表格中除 D 级以外的生产操作示例，均指在非密闭系统下的操作。

图 2 质粒生产车间主要功能区、净化区划分和关键物料走向示意图

2.2 病毒载体生产

如图 1 所示，病毒载体生产也分为上游（生产）工艺和下游（纯化）工艺。上游生产工艺包括细胞复苏、细胞扩增、转染、离心、过滤等。下游纯化工艺包括各种层析纯化和除菌过滤分装。根据表 1，可除菌过滤病毒载体生产上下游操作环境为 C 级[2]。载体生产分有毒区和无毒区，细胞复苏、发酵扩增为无毒区，从上游转染开始到下游纯化均为有毒区，有毒区均需考虑废液、废固灭活后运出。病毒载体生产功能区及洁净区划分以及关键物料走向，如图 3 所示，不可除菌过滤的病毒载体生产环境应改为 B 级。

图 3 病毒载体生产车间主要功能区、净化区划分和关键物料走向示意图

2.3 mRNA 原液生产

mRNA 药物生产，包括质粒生产、mRNA 体外转录和纯化、药物递送系统装载和无菌制剂生产，其中，药物递送系统装载如 LNP 制剂，采用脂质纳米材料需使用大量酒精，厂房设计时需考虑该生产区域的防爆设计。质粒生产和无菌制剂生产一般是独立车间生产，mRNA 原液核心生产车间主要包括质粒原液复融、质粒线性化、体外转录、纯化超滤、递送系统装载、过滤分装后送至无菌制剂车间生产 mRNA制剂。根据表 1，mRNA 原液通常可最终除菌过滤，因此生产操作环境为 C 级。mRNA 原液生产功能区及洁净区划分以及关键物料走向，如图 4 所示。

图 4 mRNA 原液生产车间主要功能区、净化区划分和关键物料走向示意图

3.3 病毒载体生产

病毒种类很多，不同种类病毒制备工艺存在一些差异，如腺病毒可以通过病毒毒液感染细胞的方式来扩大病毒产量，相比于需要使用大量 pDNA 的AAV、慢病毒等病毒载体的生产，其成本较低。目前常用于基因治疗的病毒载体包括慢病毒（LV）、腺相关病毒（AAV，单链线性 DNA 病毒）、腺病毒（AdV，大分子双链无包膜 DNA 病毒）和转录病毒（RV，RNA 病毒）。

慢病毒载体能整合进宿主细胞基因组和不具有组织特异性的特点，使慢病毒载体被广泛用于体外细胞基因治疗中。某慢病毒载体生产工艺流程主要分为上游（细胞复苏、细胞扩增、细胞转染收获），下游主要为纯化、浓缩等环节，最后为灌装环节。根据慢病毒载体的生产工艺流程，将车间按无毒区（细胞复苏、细胞扩增）和有毒区（细胞转染、纯化、浓缩等）进行严格区分，分设 2 套独立洁净空调系统[1]，如图 8 所示。

图 8 慢病毒载体生产车间平面布局示意图[1]

另一种布局思路从上游接种到下游纯化工艺流线严格采用单向流设计，分区设置独立空调系统，共享更衣区、配液区、洗消区、灭活区及物流通道等，节省了公共配套辅助区。如图 9 所示。

图 9 病毒载体生产车间平面布局示意图

3.4 细胞治疗产品生产

细胞治疗产品所需生产设备有生物安全柜或隔离器、培养箱、离心机、细胞计数仪、培养瓶或生物反应器系统及特定工艺的设备（如细胞分离和转导系统等）。其所采用的设备与管路系统可为密闭系统和非密闭系统。

图 10 为非密闭工艺条件下的厂房示意图，如图所示，工艺操作间人、物单向流动，准备间人、物非单向流动，各主操作间共用进入、退出走廊，进入和退出走廊均为洁净区。

图 10 某非密闭工艺条件下的车间示意图[1]

采用密闭设备和管道，其环境的洁净度级别可适当降低，可以考虑 C 级或 D 级[2]。如图 11 所示。

图 11 在密闭工艺条件下（如隔离器、密闭管路）的车间示意图[1]及实施案例

3.5 mRNA 生产

mRNA 生产线包含一个质粒生产线和一个mRNA 原液生产线，mRNA 原液生产核心操作间包含质粒线性化，体外转录与纯化，递送系统装载，无菌过滤浓缩，最后原液分装冻存，再运送至制剂灌装车间。结合以上工艺分析，mRNA 原液核心生产车间主要包括质粒线性化、体外转录、纯化超滤、递送系统装载（如 LNP 封装），同时考虑配套的人员、物料进出口以及配液、清洗等辅助间，如图 12所示。此外，如 mRNA 疫苗生产规模不大，一般小于 100 L，如表 2 所示，通常也可以采用类似实验室的大通间，体外转录与纯化在一个大空间下，这种方案具有不同工艺切换灵活、节省空间、节省空调系统等优点，但需要对上下游的交叉污染进行足够的风险评估。

图 12 mRNA 原液核心生产车间平面布局示意图

表 2 不同类型 mRNA 疫苗产能分析

Part.04小结

综上，本文通过分析多种常见 CGT 产品生产工艺的不同要求，提出不同的工艺平面设计方案，重点探讨不同功能分区、人、物流线规划及主要工艺辅助配套设施的规划设计方案。值得一提的是，工艺平面规划设计前，需要开展一些重要的工艺设计工作，如用户需求的调研、详细的生产排班、物料衡算、设备选型计算等，限于篇幅，本文不作展开介绍，但此部分内容也是工艺设计过程非常重要的一部分工作，要满足客户定制化需求的工艺平面，前期的工艺设计工作不容忽视，本文仅提出几种 CGT 产品平面设计思路，供业内同行共同学习探讨。

参考文献