接种条件

接种条件包括接种物、培养基成分和操作参数（图4），通过调节细胞-微载体接触频率和提供细胞粘附分子等多种机制影响细胞在微载体上的贴壁效率。因此，为了成功地进行基于微载体的细胞培养，优化接种条件至关重要。

图 4. 影响细胞在微载体上贴壁和增殖的接种条件的不同方面。

接种物

可以使用细胞团或单细胞将细胞接种到微载体上。虽然一些报告表明两者的细胞产量结果相似，但由于微载体上细胞分布不均匀和传质限制导致贴壁效率和重现性较低，因此细胞团接种并不受欢迎。为了从 2D 培养中制备单细胞以接种到微载体上，酶解主要使用蛋白水解酶，例如胰蛋白酶和 Accutase（一种源自甲壳类动物的蛋白酶）。然而，这种方法伴随着解离诱导的细胞凋亡，特别是在干细胞中，以及细胞表面蛋白的消化。为了克服前一个问题，据报道使用 Rho 相关激酶 (ROCK) 抑制剂可以有效减少 hPSC 和 hESC解离诱导的细胞凋亡。对于后一种情况，EDTA 等螯合剂将是替代蛋白水解酶的细胞解离的有前途的替代品。EDTA 除了影响细胞骨架并导致细胞变圆之外，还通过消除二价阳离子来促进细胞解离。在一项 hPSC 扩增研究中，开发了一种基于 EDTA 的方案来分离细胞以接种到微载体上。结果表明，与 Accutase 处理的情况相比，细胞产量更高，同时最大限度地减少了细胞死亡。

细胞贴壁在微载体上是一种概率现象，遵循泊松分布，并受到细胞与微球比率的影响。细胞与微球的比率值较低会导致未占据的微载体，因为每个微球接种 1、2、3 和 4 个细胞，理论上分别会导致 36.5%、13.5%、5% 和 1.8% 的空微载体。非优化的细胞接种也可能诱导大细胞-微载体聚集体的形成，正如在 hMSC 和小鼠 ESC 中观察到的那样。因此，需要足够高的细胞与微球的比率，以在微载体上具有适当的细胞分布，其中没有微载体保持未被占据。另一方面，该比率非常高的值会导致大量未贴壁的细胞和接种物的浪费。通常，使用每球 3 至 5 个细胞的理论值，但不同的研究人员报告了不同细胞和微载体的各种最佳细胞接种浓度。例如，FS-4、包皮成纤维细胞的细胞与微球比率为 6，Vero 细胞的细胞与微球比率为8和 30，hMSC 的细胞与微球比率为 3 至 5、 MDCK 使用比率 7。应该注意的是，最佳细胞接种浓度可能会因不适当的接种条件而增加，例如营养缺乏的培养基、使用对数生长期后期的细胞、非最佳微载体类型、不利的pH以及细胞损伤。

接种阶段的微载体浓度非常重要，它影响最终的细胞产量，除了细胞与微球的比率之外还应该考虑该因素。对于干细胞的扩增，已报道了各种范围和值，包括 2.5–12.5g/L、1–20g/L和 30g/L。尽管由于需提供更大的表面积而更倾向于较高的微载体浓度，但由于颗粒碰撞的增加，该参数的增加可能对细胞生长产生负面影响。此外，在高密度培养的情况下，应采用提供足够氧气（即通气）和营养（即更频繁的培养基置换）的操作方法。

培养基

传统上，动物细胞培养基由添加有血清的基础培养基组成，最常见的是动物来源的血清。动物源性血清，例如胎牛血清 (FBS)，提供细胞贴壁和增殖所需的粘附分子（例如纤连蛋白）。这里的一个重要问题是，微载体表面的化学成分决定了从血清吸附到微载体上的蛋白质的类型和数量，这对细胞贴壁、增殖和分化行为有影响。已经证明，DEAE包被的微载体，如Cytopore-2和Cytodex-1，主要吸附白蛋白这种非粘附分子，导致细胞贴壁和生长减少。此外，有人解释说，壳聚糖微载体上的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）不适当的增殖是由于这些基质上含血清培养基的纤连蛋白吸附率较低。相反，色谱研究表明明胶（或变性胶原蛋白）与纤连蛋白特异性结合。因此，Cultispher-S 和 Cultispher-G 微载体（基于明胶的微球）完美支持 MSC 在含血清培养基中的贴壁和生长，以及血清预处理后的 Vero 细胞。从操作的角度来看，应该考虑到培养基中血清存在一个最佳浓度，在该浓度以上，细胞贴壁不会发生显著改善，如在 Vero 细胞的情况下观察到的那样。

尽管动物源性血清具有支持作用，但一些主要的临床问题与血清在细胞培养工艺中的应用有关，即血清的批次间差异性、其不明确的性质以及可能存在的污染物，例如血清中的朊病毒、病毒和人畜共患病原体。就干细胞而言，这些问题变得更加重要，因为干细胞本身就是治疗产品，任何导致这些产品不可预测行为的因素都应该被消除。此外，为了符合 cGMP 条件，培养基应包含明确的材料。因此，开发提供细胞贴壁和增殖营养需求的无异源化学成分培养基一直是人们感兴趣的主要课题。一些报告表明在细胞培养过程中成功使用了无血清培养基。对于 MSC 扩增，Mesencult-XF (Stemcell Technologies) ]、Becton Dickinson (Franklin Lakes) Mosaic hMSC 无血清培养基 (BD-SF) 和 StemPro® (Life Technologies) 是其中一些已报道的无血清培养基。此外，名为 E8™ 的无异源培养基已被证明能够成功支持 hPSC 和 hiPSC 的扩增。

在基于微载体的培养环境中缺乏粘附分子的情况下，细胞必须分泌自己的 ECM 来完成贴壁和生长。据报道，一些细胞，例如原代细胞（人包皮成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞）和二倍体细胞类型（WI-38、MRC-5）能够分泌大量纤连蛋白，足以使其在无血清条件下扩散。然而，许多正常细胞系（例如，BHK-21-C13、BALB 3T3）和转化细胞系（例如，BHKpy、CHO）在没有为其扩散提供额外的粘附分子的情况下不会扩散，因为这些细胞的 ECM 分泌量较低。

操作参数

尽管有报告表明成功地将细胞静态接种到微载体上，但已经证明，由于增强的细胞贴壁力，搅拌通过增强微载体接触，对细胞贴壁到微载体具有促进作用。此外，施加搅拌会导致微载体上的细胞分布更加均匀。然而，搅拌方案（即除叶轮类型之外的搅拌速率和周期）应进行优化，以避免细胞损伤和细胞-微载体聚集体形成。据报道，将搅拌期和非搅拌期结合在一起的间歇搅拌方法是一种在微载体上进行细胞接种的有效策略，因为它提供了搅拌的优势并保证了细胞粘附在微载体上。该策略已广泛用于干细胞的扩增，包括 hPSC、hMSC 和小鼠 ESC。然而，就贴壁率和聚集体形成而言，这种搅拌方法不一定会导致细胞与微载体的最佳贴壁。在一项关于 Vero 细胞贴壁到 Cytodex-1 微载体上的研究中，表明与间歇方法相比，连续搅拌导致细胞贴壁量更高，细胞聚集体数量更少。这表明在优化搅拌策略时应考虑细胞和微载体类型。

考虑到动物细胞对机械力的敏感性，大多数研究都集中在使用所有微载体悬浮在生物反应器中的最小搅拌速率，称为“正好悬浮”速率（just-suspended，NJS）。在 Heathman 等人最近的一项研究中，针对 hMSC，研究表明，将叶轮速度降低到 NJS 以下会导致结块和取样困难，而在 ~2 NJS 下工作会降低细胞生长，但~1.3 NJS搅拌速度不会降低细胞生长。由于细胞质量在该搅拌速度范围内保持完整，因此有人提出细胞生长的减少是由于贴壁效率较低，而不是由于剪切应力对细胞造成损害。此外，叶轮类型的选择和设计应增加代表涡流尺寸的柯尔莫哥洛夫微尺度湍流。最小的涡流应大于微载体，以避免流体动力应力引起的细胞损伤。

在生物反应器中获得高细胞密度的一种策略是应用多孔微载体，因为位于这些微载体孔中的细胞将受到保护，免受强烈的机械力的影响，并且与实心微载体相比，它们提供更高的表面积与体积比。然而，使用多孔微载体的主要障碍是，由于孔径较小，大多数细胞可能无法进入孔内。为了解决这个问题，最近的研究结果表明，Janus 微球（具有两个物理和化学上不同的区段的多室颗粒）在多孔微载体的制造过程中的应用导致形成更大的孔，促进细胞浸润和增殖。

总体而言，很明显，接种条件对基于微载体的细胞培养中细胞贴壁和生长的影响取决于细胞和微载体的类型。数学模型将是模拟细胞生长和确定最佳接种条件的强大工具。透彻了解微载体上细胞贴壁机制和细胞生长的生物学属性是开发真实细胞生长模型的先决条件。此外，由于操作参数的变化会影响细胞聚集以及最终细胞产量，因此应根据所需的细胞形式（即细胞聚集体或单个细胞）确定最佳接种条件。

原文：S.Derakhti, S.H.Safiabadi-Tali, G.Amoabediny, et al., Attachment and detachment strategies in microcarrier-based cell culture technology: A comprehensive review. Materials Science and Engineering: C, 2019.