腺相关病毒 (AAV) 是一种新兴的基因治疗载体。AAV 将治疗性 DNA 有效载荷包装在病毒衣壳内。这种 DNA 有效载荷限制为约 5 kb 的 DNA，可用于基因编辑、基因沉默或基因替换。一旦 AAV 到达靶细胞，AAV 就会被内化并运输到细胞核，在那里，递送 DNA 有效载荷，并表达治疗产物。

使用 AAV 进行基因治疗有很多优势。AAV 通常被认为是安全的，可以直接输送到患者体内，并且可以靶向不同的组织并穿过血脑屏障。还可以对衣壳进行改造，以提高组织特异性、效力和安全性。因此，许多基于 AAV 的基因疗法正在开发中，其中一些已获得全球监管机构的批准。

空/完整衣壳比是 CMC 的一个重要考虑因素。一个控制良好的工艺将产生在批次间具有可比性的空衣壳、部分衣壳和完整衣壳比例。因此，用于量化 AAV 的空/完整比的适当方法是重要的分析工具。然而，有许多技术可以做到这一点，选择最合适的技术可能是一个挑战。在这里，将介绍 10 种不同的技术，并评估它们的分析强度、易用性以及在 GMP 环境中实施的能力。

AAV 空/完整衣壳比是一个重要的质量属性

包含所需 DNA 产物的 AAV 被认为是完整的衣壳。然而，除了完整的 AAV 之外，最终制剂中还可以存在其它衣壳类型。空衣壳不包含目的 DNA。它们可能真的是空的，或者它们可能包含小块 DNA，如 AAV ITR 或宿主细胞 DNA 或质粒 DNA 的片段。部分衣壳可能包含完整 AAV 基因组的片段。与单链 AAV 基因组相比，部分衣壳在具有自我互补 AAV 基因组的项目中更为普遍。

完整的 AAV 是最有效的：它们包含所需的 DNA 产物。没有治疗用 DNA 的空衣壳对产品的效力没有任何贡献。相反，它们可能通过递送 DNA 的免疫原性片段以及增强患者对 AAV 衣壳的免疫系统反应来促进免疫原性。根据包装的 DNA，部分衣壳具有不同的效力。如果包装的基因组恰好编码功能性蛋白质，则部分衣壳可能会对效力产生积极影响。因此，除了提高整体衣壳产量外，工艺开发小组还需尝试优化完整衣壳的百分比。

AAV 空/完整测定方法

表征和量化 AAV 空/完整比有四种主要方法：

• 单独测量 DNA 滴度和衣壳滴度

• 基于空衣壳和完整衣壳之间电荷差异的分离

• 基于质量和大小的分离

• 成像技术

DNA 和衣壳的测量

ddPCR 和 ELISA

使用 ddPCR 和 ELISA 测量空/完整衣壳比的原理很简单：ddPCR 测量 DNA 浓度（载体基因组数/mL），ELISA 测量蛋白质浓度（衣壳数/mL），以及计算DNA – 衣壳比值（载体基因组数量/衣壳数量），以给出完整和空衣壳的数量。

虽然这种方法易于执行且不需要任何专门设备，但它有其缺点。ddPCR 无法量化部分衣壳。根据引物设计和部分基因组的序列，引物要么识别部分基因组，导致高估完整衣壳的数量，要么引物无法识别部分基因组并高估空衣壳的数量。ELISA 取决于抗体的准确性和可用性。抗体可以识别衣壳片段，并且可能存在批次间差异。较差的校准曲线可能会影响计算的衣壳滴度。最后，由于使用 ddPCR 和 ELISA 来衡量空/完整比涉及结合两种独立技术的结果，因此报告的结果涉及两种错误来源的混合，这可能导致高分析可变性。

UV-Vis

UV-Vis光谱法采用 DNA 基因组和蛋白质衣壳的摩尔吸收系数，并计算样品中存在多少 DNA 和蛋白质。可以使用软件计算载体基因组的数量和衣壳的数量，并且像ddPCR和ELISA一样，测量空衣壳和完整衣壳的比例。因为部分衣壳没有与空衣壳和完整衣壳分开，来自部分衣壳的信号被分配给空衣壳和完整衣壳。

因为没有分离衣壳，DNA 和蛋白质杂质都会影响UV-Vis读数。根据我们的经验，UV-Vis 对于非常纯的样品最为准确。然而，根据我们的经验，即使是最纯净的样品，UV-Vis通常也会大大高估空衣壳的数量。UV-Vis 可能是一种有用的方法，适用于试图获得快速（但不一定准确）滴度值的分析团队。

尺寸排阻色谱法 - 多角度光散射 (SEC-MALS)

SEC-MALS 将尺寸排阻色谱（将单体 AAV 与二聚体、聚体和其它杂质分离）与一套分析检测器（如光散射、紫外检测和示差折光检测器）相结合。这些检测器一起可以报告溶液中 AAV 的大小、衣壳滴度和基因组滴度。但是，由于空衣壳、部分衣壳和完整衣壳作为一个单体峰一起洗脱，SEC-MALS 会将来自部分衣壳的信号分配到空衣壳和完整衣壳之间，类似于 UV-Vis。

根据我们的经验，SEC-MALS 是一种强大的分析技术，具有合理的线性度并且可重现。就其弱点而言，我们已经看到 SEC-MALS 偶尔会高估空衣壳的数量。它的软件使用起来也可能有点棘手。由于 SEC-MALS 无法区分部分衣壳，因此它可能更适合部分衣壳较少的 AAV 项目。

基于电荷的分离

完整衣壳比空衣壳具有更低的 pI（负电荷更多，酸性更强）。这种差异允许基于 pI 的分离。根据我们的经验，部分衣壳和完整衣壳具有相似的 pI，这使得这两个物种的分离具有挑战性。基于电荷的分离因翻译后修饰而变得复杂，这可能会影响表面电荷。这些分离也依赖于血清型，这意味着基于一个项目建立的方法可能不容易转化至另一种项目。

阴离子交换层析 (AEX)

在 AEX 中，与较早洗脱的空衣壳相比，带更多负电荷的完整和部分衣壳在柱上的保留时间更长。在一个好的 AEX 方法中，空衣壳和完整衣壳通过基线分辨率相互分离。作为一种基于柱层析的方法，AEX 易于执行、稳健且准确。

然而，建立 AEX 方法可能具有挑战性，因为层析柱、盐类型、浓度和缓冲液 pH 值的选择都会影响分离质量。此外，某些血清型通过 AEX 进行分析更具挑战性。

毛细管等电聚焦 (cIEF)

cIEF 根据 pI 沿 pH 梯度分离空衣壳和完整衣壳。使用良好的 cIEF 方法，空衣壳和完整衣壳将充分分离，从而可以进行量化。cIEF 需要高纯度样品，因为杂质峰可能不容易与蛋白质信号区分开来。虽然 cIEF 可以提供有关样品内电荷异质性的高分辨率信息，但充分分离空衣壳和完整衣壳可能具有挑战性。翻译后修饰会导致峰相互融合，从而使该分析进一步复杂化。

质量和尺寸分离

沉降速度 - 分析型超速离心 (SV-AUC)

SV-AUC 是一种离心形式，其中 AAV 基于它们的 Svedberg 系数分离，Svedberg 系数是粒子质量、大小和形状的度量。从广义上讲，空衣壳的 Svedberg 系数低于完整衣壳。除了提供空衣壳和完整衣壳的高分辨率分离外，SV-AUC 还可以分离部分衣壳。

然而，SV-AUC 在 GMP 环境中的实施具有挑战性。它需要大量的手动操作，数据分析也很耗时。尽管如此，由于能够准确分离和量化空衣壳、部分衣壳和完整衣壳，SV-AUC 是许多 AAV 项目的黄金标准。

电荷检测质谱 (CDMS)

CDMS 是一种新兴的质谱分析形式，可同时测定完整衣壳的质荷比 (m/z) 和电荷 (z)。将这两个值相乘可以确定完整的衣壳质量 m。对于 5.1 MDa 完整衣壳，典型的 m/z 值是 30,000 和 +170（30,000 m/z * 170 z = 5,100,000 Da）。根据我们的经验，CDMS 和 AUC 结果非常接近，这意味着 CDMS 可能是分析实验室中 AUC 的合适替代品。

原子力显微镜 (AFM)

AFM 可探测沉积在成像表面上的 AAV 的物理化学特性。空衣壳更“柔软”，看起来比完整衣壳小。也可以观察到疏水性和表面电荷的差异。然而，由于空衣壳和完整衣壳的特征可能重叠或差异可能很细微，AFM 可能更适合作为表征方法而不是空/完整确定方法。

成像技术

低温透射电子显微镜 (cryoTEM)

CryoTEM 是一种测量 AAV 衣壳内电子密度的成像技术。由于 DNA 的存在，完整衣壳在其内部具有高电子密度（高对比度），而空衣壳几乎没有对比度。CryoTEM 还可以尝试将具有中等对比度的衣壳量化为部分衣壳，但需要一个好的算法来确定什么是低（空）、中（部分）或高（完整）对比度衣壳。我们还观察到 cryoTEM 可能高估了我们样品中空衣壳的数量。

质量光度法

质谱光度法是一种成像技术，它观察 AAV 落在显微镜载玻片上时散射的光量（或对比度增加）。完整的 AAV 将在显微镜载玻片上显示为比空 AAV 更暗的点（具有更大的对比度）。通过测量着陆在显微镜载玻片上的 AAV 数量和着陆事件的对比度或强度，可以确定空/完整比。

质量光度法的一个优点是它是一种快速技术（每个样品大约五分钟）并且易于执行。作为一种单分子技术，它提供了关于样品异质性的非常详细的信息。然而，虽然质量光度法可以区分部分衣壳，但分辨率不是很好，这意味着部分衣壳和完整衣壳的分布可能会相互渗透。我们对该仪器的初步结果表明，质谱光度法会将部分衣壳错误分配为完整衣壳。

选择空/完整分析方法

选择空/完整量化方法高度依赖于研究背景。在 GMP 环境中，没有任何一种技术是准确、快速、易于使用和易于实施的。如果部分衣壳是原料药的重要部分，则 SV-AUC、CDMS 和质谱光度法是最合理的方法。虽然 CDMS 可能是最容易执行的，但 SV-AUC 具有可以在 GMP 环境中实施的优势。由于质量光度测定快速且易于执行，因此它可能对工艺开发团队筛选各种工艺很有用。

如果不关心部分衣壳，那么基于柱层析的方法应该是强有力的候选者。如果血清型适用于离子交换层析，则阴离子交换层析是一种准确且符合 GMP 的技术。SEC-MALS 也是一个合理的选择，但必须注意确保方法准确。

Cryo-TEM 主要作为一种中等技术，因为它区分部分衣壳的能力值得怀疑，而且准确性一般。UV-Vis 可能对有兴趣快速估计空/完整衣壳比的工艺团队有用。除非可以充分分离空颗粒和完整颗粒，否则 cIEF 和 AFM 可能更适合作为表征技术，而不是绝对量化方法。最后，必要时，可以使用 ddPCR 和 ELISA，但必须彻底验证这些方法，以确保结果准确。

原文：J.Ong, Advanced Analytical Approaches For AAV Empty/Full Capsid Characterization And Quantification. Bioprocess Online, 2023.

撰稿人 | 生物工艺与技术

责任编辑 | 胡静

审核人 | 何发