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  冷冻保存技术市场趋势    

常规低温储存设备，包括不同储存温度级别的低温保存箱、医用冷藏箱、冷冻箱、超低温冰箱、液氮罐等，据相关市场研究报告[1]，2021年市场规模约13.5亿美元，复合增速约17%。此部分仅包含低温储存设备，如果考虑包括细胞冻存设备及附件、耗材和试剂等在内的整个冷冻保存市场，据Coherent Market Insights报告，全球冷冻保存市场2022年约80亿美金，并将在2022~2030以13.2%复合增速增长[2]。但这仍然不包括面向生物大分子原液冻存的冻融系统部分。据Persistence Market Research报告，全球冻融系统市场规模2022年约3.45亿美元，复合增长率约6.8%，包括模块化冻融系统、可控速冻箱、一次性袋子、运输箱等，其中冻融系统约占全球冷冻保存市场的7.1% [3]。

尽管不同机构统计的市场范围不同，但随着更多生物药和细胞基因疗法的开发和上市，全球冷冻保存市场将保持较高的增速。驱动该市场增长的因素包括：

• 随着更多复杂生物药和先进治疗方法进入临床，应用端对冷冻保存技术的需求不断增加

• 低温生物学的学术发展和技术创新，如玻璃化冷冻技术，使冷冻和复苏活性损失更小，从而冷冻保存技术能够应用到更多生物制品领域

• 生物药物冻融过程研究使其能更普遍地应用于复杂结构和制剂产品的大规模冻存

可能阻碍冻融系统应用从而减缓市场发展的的因素主要包括：

• 系统建设和使用成本高

• 批量较大时需要使用多套冻融系统

• 大规模冻融系统成本高，不便于中小企业采用

• 一次性使用耗材的耐用性，操作过程中易造成破损

• 一次性使用耗材溶出析出使产品污染

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  为什么要研究和控制冻融过程    

越是结构复杂和对温度变化敏感的生物样本，其在冻融循环中损失的活性可能越多。对于细胞冻存而言，学术及工业界一致认为需要进行冻融过程的研究开发和控制，因为经过冻融循环后细胞的存活率及代谢变化较大，必须进行工艺优化以减少细胞损失。许多抗体或酶产品的推荐保存条件为冷冻保存，并建议进行分装以避免反复冻融造成活性损失。

以细胞冻存为例，其低温冷冻保存有慢速降温和快速降温两种冷冻方法。慢速降温通常采用“两步法”，即先用较慢的降温速率冷冻至-80°C并维持一段时间，再转移至液氮储存。采用程序降温设备也可以慢速降温至-135°C或更低再转移至液氮储存。采用较慢的降温速率可以减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。快速降温又称玻璃化冻存，即以极快的降温速率使样本没有足够的时间形成冰晶就直接转变为玻璃态，但该方法局限性较多，只适用于微量级样品。

不论是对于细胞、病毒，还是蛋白、核酸等生物大分子，冻融过程都直接影响其产品质量，因此属于关键工艺步骤，需要对关键工艺参数进行研究、验证和控制，以确保最终产品质量在可接受范围。工艺验证应能够代表实际生产规模的工艺。

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  可控冻融技术的发展现状    

影响冻融过程的影响因素众多，包括目标产品、冻融设备、冻存容器、冷冻保护溶液体系等。当前，基于不同的冷冻保存需求，应用于不同冷冻对象和应用场景下的冻融技术各不相同。理论而言，储存于溶液的玻璃化转变温度以下时，整个体系呈玻璃态，内部分子链和链段都无法运动，仅构成分子的原子或基团可以在其平衡位置振动，从而使分子的降解反应完全停止。纯水的玻璃化转变温度为-135°C。

对于组织样本或细胞的冻存，周期较长时需储存于液氮罐。根据样本量的大小，常用上文所述的快速冷冻和慢速冷冻方法。慢速冷冻可以通过程序降温盒、超低温冰箱、程序降温仪等工具实现。程序降温仪又分为液氮制冷和无液氮两类，液氮制冷程序降温仪需要持续供给液氮并通过控制液氮供应速率来控制冷冻速率，无液氮降温仪则通过压缩机制冷从而免除了对液氮的依赖，但制冷温度限于-100°C，因此需要转移至液氮罐完成第二段冷冻。复苏则常用38°C水浴、金属浴、程序复苏设备等。

对于病毒和蛋白、核酸等生物大分子，通常只需要保存于-20°C至-80°C，因此根据储存体量，常用超低温冰箱、冷库等进行储存。在许多操作中，超低温储存设备也被直接用于冷冻降温过程，该过程被称作被动冷冻。与之相对应的，采用冷冻程序可控的速冻箱或冻融系统的冷冻过程被称作主动冷冻。复融过程常用38°C水浴、室温放置、可控冻融系统等。

▼ 常见冻存应用和容器设备

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  待解决的问题，机遇与挑战    

由于当前主流冻融技术制冷和加热均采用热传导的方式，热传递效率受温差、接触面积和传导介质影响，在放大性、冻融速率、温度均一性、容器兼容性等方面存在诸多限制。

比如，当样本体积在μL级别时，冷冻速率可达几十°C/min甚至更快，然而当体积达到L级别时，冷冻速率甚至无法达到1°C/min。这也就意味着，如果在小规模工艺研发时不考虑大规模的限制，所开发的工艺可能无法放大。样本体积增大时，需采用不同的冻存容器，而更大体积的冻存容器通常意味着更长的冷冻距离（最后冷冻点至容器表面的距离）和更低的比表面积（影响传热速率）。一个典型的例子即是冻存瓶的冷冻，放置于-80°C的冷冻腔体中，冻存管中几mL的样品可在1小时内完成，而冻存瓶中3.5L的样品需要24小时甚至更长时间[6,7]。

▲ 24x 3.5L水在超低温冰箱的冷冻过程[7]

同一腔室内不同样品间的冷冻温度均一性是另一挑战，这意味着样品间的冷冻速率不一致。如上图所示，不同样品在到达-20°C时的时间差40小时，在同一时间的温度差达30°C以上。样品间的温度差异很大程度上受空气对流传热的稳定性影响，比如在依靠空气对流传热的腔体式冷冻设备中，气流分布在样品间不均匀、存在气体滞留或低速区域。空气自然对流换热系数约5~25 W/(m2*K)，而空气强制对流的换热系数约20~300 W/(m2*K)，这就意味着空气流速对传热效率的影响非常大。

为了应对空气传热效率低、样品温度均一性差、可放大性不好等问题，金属浴接触式和平板接触式冻融系统被开发并应用。接触传热被认为比气体对流传热系数更高，并且温度控制更均匀。比如，Ross.pFTU系列平板冻融系统的测试显示冷冻速率和均一性明显提高，16x 14.5L样品在12小时内完成冷冻，样品到达同一温度的时间差控制在2小时以内[8]。然而，接触式平板冻融设备对冻存容器有特定要求，只能采用一次性袋子并通过保护壳形成平整的接触表面，而冻存瓶类的容器则受限于接触面积，不能有效进行平板接触传热。

▲ 16x 14.5L样品在平板冻融系统中的冷冻过程[8]

从实现生物制品的长期活性保存的目标来说，通过产品结构设计和稳定缓冲体系开发，增强内在稳定性才能从根本上解决问题。然而，就需要通过冻融技术来实现稳定保存的组织、细胞和生物大分子而言，以热传导为基础的冻融技术的升级优化机会在于：

• 更可控和快速的冻融速率和温度范围

• 提升对于不同规格和形状容器的兼容性

• 提升温度控制的均一性

从传热效率而言，接触传热>空气强制对流>空气自然对流，因此，应尽可能增加接触传热，同时利用空气强制对流。由于冻存容器与冻融设备通过接触传热的同时，仍有大量表面未充分接触，因此，利用空气强制对流改善非接触表面的热传递能够进一步提升传热效率。同时，强化空气对流的方法同样适用于冻存管、冻存瓶等主要通过空气传热的冻存容器，从而解决了多规格和形状容器的兼容性问题。 (注：专利技术，若需进一步了解可联系小编)

从大规模商业化生产需求出发，冻融系统的发展主要是从单机设备到整体解决方案，满足整个生产流程中所需的分装、冷冻、转移、储存、运输、复融等操作需求，包括使操作更加人性化和自动化以提升生产效率、减少手工操作难度、提升便捷性和安全性等。

然而，通过热传导进行冻融过程传热始终面临样本体积大时样本表面和内部传热慢和不均一的问题，因此，在放大至器官、生物体或大规模大分子原液时，现有冻融技术难以实现快速均一的冷冻、玻璃化和复融，从而最小化活性物质、细胞或器官的损伤。想要实现《三体》等科幻著作中所描述的人体冬眠，似乎科学界还需要革新热量传递技术。

撰稿人 | 生物创客

责任编辑 | 胡静

审核人 | 何发