分析方法耐用性研究与统计学评价

曾文亮 2023-09-26

药物质量研究中，含量杂质分析方法验证得到了广泛的关注与应用，包括线性、精密度、准确度、专属性、范围、检测限与定量限等。分析方法耐用性也逐渐受到行业的重视。近年来新药发展迅速，医药外包服务行业风起云涌，技术的不同场地转移非常普遍，不同场地研发分析与质量控制实验室间的分析方法转移也经常发生。因此方法转移时，不仅要符合法规的要求，还要求实验室的检测结果具有可比性，这些都对分析方法的耐用性提出了新的要求与挑战。

在ICH Q2A指南中，方法耐用性的英文名称为“robustness”，它与USP的解释是一致的，定义为“是衡量其不受方法参数的微小故意变化影响的能力，并在正常使用期间提供可靠性的指标”。笔者在一些文献或书籍中有时会见到“ruggedness”一词来表示耐用性。严格来说，它表示方法的粗放性。USP对“ruggedness”解释为分析方法在各种正常试验条件下，如不同的实验室、不同的分析员、不同的仪器、不同的试剂批次、不同的分析时间、不同的分析温度下，对同一样品进行分析所获得试验结果的可重现性程度。这个叙述的含义基本等同于中间精密度，因此“robustness”与“ruggedness”两者的含义是有区别的，在使用时需要注意。

ICH Q2A指南中对方法耐用性的评估明确指出：耐用性评估的结果应是建立一系列系统适用性参数（例如测试分离度）评估，以确保在使用时保持分析方法的有效性。本文试着从耐用性的评估方式、程序、实验设计与案例分析等方面展开探讨液相色谱方法耐用性的研究。

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方法耐用性的评估方式

据ICH/USP对方法耐用性定义，方法参数故意的微小变化，选择合适的响应值或者系统适用性结果来进行评估。分析方法的影响因素有多种，包括样品提取方式、流动相组成、pH值、流速、柱温和梯度等。

第一种评估方式是一次实验只测试一个方法因素的一个水平变化，比如一次只改变流动相pH值，其它方法参数保持不变，后得到一个因素变化后的测试结果，这种方式称为单变量一次实验（one-variable-at-a-time procedure(OVAT)）。可以看出这种方式简单易操作，一次只变化一个因素和一个水平，因素间不同时考察。如果因素较大，则实验次数也会较多，方法因素间的交互没法评估，实验得到的是单变量结果，无法进行统计学评价。

第二种方式是同时评估多个参数的变化，进行实验设计，利用统计学软件进行分析。根据参数进行实验设计，考察的是多因素多水平对方法的影响，得到的结果对于方法耐用性的判断更具有意义。

方法耐性的评估流程大致如下，参考图1：

选择方法的考察因素与变化水平
选择一种实验设计方法
选择需要测试的结果（如分离度，含量回收率）
计划与执行实验设计，收集测试结果
量化计算因素对结果的影响
对实验结果进行图表或统计学分析影
根据上面的评估，总结考察因素与水平对于方法耐用性的影响

图1 分析方法耐用性测试的流程步骤

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方法耐用性因素与水平的选择

不同实验间方法转移常会受到环境因素与操作因素的影响。方法耐用性考察主要研究那些操作因素对方法的影响，比如流动相pH值、缓冲盐浓度、柱温、色谱柱厂家与柱批次等。这些因素中有的是可定量因素，如浓度、pH值；有的是可定性因素，如色谱柱厂家与批次。高效液相色谱法可操作因素如表1.

表1 HPLC方法的耐用性因素

因素水平的选择一般基于方法正常水平选择大小两个水平。水平的大小要考虑该因素的不确定度。比如柱温，不同色谱仪的柱温不确定度可以做到±2ºC或者更低，在考察柱温的水平时，基于这个不确定度来考察柱温的2-5倍因子。方法正常柱温是30ºC时，则考察25ºC和35ºC两个水平。这种选择常依赖于分析操作人员的判断与经验，对方法熟悉的操作人员，在方法开发时会考察一些关键影响因素，因此对方法的知识了解会比较多，耐用性考察选择水平能做到适度调整。水平考察过宽得到的结果可能会测试结果影响较大，分离度小于1.5或者含量回收率低于90%；水平考察过窄，可能会没有找到因素影响的最大可能耐用性区间，耐用性评估意义会打折扣。

因素与水平变化后的检测结果可有多种，比如检测分离度、含量回收率等。这些响应结果用来评估因素与水平的变化对方法的影响。表2列出了高效液相色谱法耐用性可选择的检测结果种类。

表2 HPLC方法耐用性的检测评估结果

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方法耐用性的实验设计

方法耐用性的实验通常是考察两个水平的结果变化，基于考察因子的多少，选择部分因子（fractional factorial, FF）或者筛选因子（Plackett-Burman,PB）实验设计。假设有f个因子，对于部分因子实验设计则需要进行2f-k（f:因子数，k：新安排的因子数）次数的实验；当考察因子超过4个，部分因子实验的次数也会增加较多，实验室分析工作量会陡增。另一种可以选择筛选因子实验设计，实验次数是12,20,24等，是实验最少的一种设计。它的缺点是当因子之间存在显著的交互作用时，实验结果无法准确检测到。

方法耐用性考察时，色谱方法影响因子常大于4，因此选择筛选因子实验设计能节省次数。表3是筛选因子设计表，包含了11个因子，每个因子两水平，基本可以满足耐用性的考察。

表3 筛选因子设计表，“+”代表因子的高水平，“-”代表因子的低水平

实验设计完成后，执行实验操作，得到各因子高水平与低水平的结果，进行处理。不同水平的因子对方法的影响效应（EX）计算可以通过下面公式得到：

计算得到因子影响效应的结果，然后可通过人工或者软件计算得到图表化的统计数据分析，进一步识别某些影响因子效应是否显著，从而判断因子对方法耐用性是否产生了统计学上的影响。

图2是根据EX结果得到的正态或半正态分布概率图，显著影响因子效应通常是偏离直线，如图圈出的点。此外，通过实验设计得到的实验结果可以结合通过统计学软件进行t检验分析，一起评估因子的影响效应。

图2 a: 因素影响效应的正态分布概率图，b: 因素影响效应的半正态分布概率图

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案例：MC片剂的含量杂质HPLC方法的耐用性考察

该片剂API成分为MC，同时含有两个主要杂质成分RC1和RC2。样品测试溶液有两份：一份含有0.25mg/ml MC和0.0125mg/mL RC1与RC2标准品溶液；另一份含有0.25mg/ml MC的片剂样品溶液。

色谱柱：10cm × 4.6 mm I.D. column, packed with Hypersil BDS-C18, 3 mm，柱温：室温，流速1.5mL/min，波长265nm，水相pH6.8,进样量10uL，流动相组成与梯度条件如下表：

根据前文叙述的方法影响因素分析，该方法耐用性考察因素选择流速、水相pH值、柱温、色谱厂家、梯度起始与终点的变化、缓冲盐浓度和检则器波长。具体的因素与水平选择如表4。

表4 方法耐用性的因素与水平

上表选择了8个因素考察，利用筛选因子实验设计模型，选择11个因子12次实验的设计表格，如表5, 由于方法考察8个因子，故实验设计表中有三列是虚拟的因子，我们可以随机选择三列作为虚拟考察因子（如C、G、K列）。

表5 筛选因子实验设计

通过上表的实验设计，开展12次实验，每一列代表一个方法条件，分析分析三针样品（空白、标准品样品和样品溶液）。实验完成后，收集检测的结果包括MC、RC1和RC2的回收率，MC与RC1的分离度，主峰MC的容量因子，主峰的拖尾因子，最后出峰RC2的保留时间，具体见如表6。从结果来看，主要成分MC与两个杂质RC1和RC2的含量回收率都在95%-105%的范围内，精密RSD值在2%的范围内，化合物分离度也都大于1.5, 说明方法在考察因素发生微小变化时，耐用性良好。

由表6的结果，参考公式1, 可计算因子随水平变化时对方法的影响效应，正态分布概率图显示所有点几乎在一条直线上，没有明显偏离直线的异常值，具体图表结果可见文献1。对表6结果进行统计学t检验分析，结论也是没有因子对方法产生的显著影响，如表7。表7中前三列的回收率结果显示在α=0.05水平时，没有观察到显著性影响，说明方法准确度没有受到因子水平变化的影响。后面4列有观察到统计学显著性差异，说明方法因子水平的变化对检测结果（分离度、容量因子，拖尾因子和保留时间）产生了显著性影响，但这并不意味着方法耐用性不好，也不说明方法没有在最好状态。因为方法的耐用性好与不好，最后反应在它的定量准确性上。

表6 12次实验的结果汇总

表7 不同因素考察结果的统计学分析

我们可以利用这些受影响的因素找到那些最差的检测结果。比如，pH值、色谱柱、柱温、B相终比例、缓冲盐浓度等5个因子会显著影响分离度、MC容量因子和拖尾因子，而B相起始比例、流速和波长等3个因子对方法不产生影响。根据前面5个因子的影响效应量化结果，选择产生负面影响的5个因子的水平（+或-），不产生影响的3个因子选择方法的正常水平（0），进行最差情形实验，从而得到分离度、MC容量因子和拖尾因子大方法波动时的可能区间，这些值可作为方法状态最差时的参考值。在设计方法系统适用性的限度时，依据这些最差值来进行设定，如表8。

表8 (a)计算结果预测的最差情况的因素水平；(b) 上述不同水平条件测试后的SST结果