全方位了解RSV疫苗关键工艺流程

Sun Honglin 2023-08-31

呼吸道合胞病毒（respiratory syncyial virus，RSV）是一种反式单链RNA病毒，共编码11种蛋白，其中病毒表面的G粘附蛋白（Attachment Protein）和F融合蛋白（Fusion Protein）在RSV感染过程中发挥重要作用，G糖蛋白主要负责将病毒吸附到宿主细胞表面启动感染过程，F糖蛋白则介导病毒入侵和将周围的细胞进行融合形成合胞体，分为融合前（pre-F）和融合后（post F）构象，二者是产生中和抗体最重要的抗原位点，也是诱导机体产生免疫原性和抗病毒的最主要靶点。感染呼吸道合胞病毒会导致黏液分泌增加及发炎，导致气道变窄，是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原体。

图1. 呼吸道合胞病毒RSV结构图

RSV疫苗研发源自20世纪60年代，福尔马林灭活疫苗（FI-RSV）的失败严重打击了RSV疫苗的研发热情，增加了RSV疫苗研发的商业风险，使RSV疫苗研发举步维艰。2023年5月3日，葛兰素史克宣布其重组RSV疫苗（RSVPreF3）获得FDA批准，商品名为Arexvy，用于预防60岁及以上老年人RSV感染，为全球首款RSV疫苗。同年5月31日，辉瑞宣布FDA已批准其无佐剂二价RSV疫苗（RSVpreF，PF-06928316）Abrysvo上市，用于预防60岁及以上人群出现由RSV引起的下呼吸道疾病；同年8月21日，该款疫苗被FDA批准作为第一款用于保护新生儿的RSV疫苗，通过给怀孕32-36周的孕妇进行主动免疫，保护从出生至6月龄婴儿免于RSV感染。

有数据显示， 目前全球在研的RSV疫苗超60款。其中，国外布局RSV疫苗的企业除了上述提到的GSK、辉瑞外，还有Moderna、Novavax、赛诺菲、第一三共等。至于国内，入局RSV疫苗的企业包括艾棣维欣、嘉晨西海、沃森生物/蓝鹊生物、石药集团、艾美疫苗/丽凡达生物等。

表1：中国布局RSV疫苗的企业

从技术路线来看，目前RSV疫苗的研发主要集中在四大类疫苗，包括减毒活疫苗、病毒载体疫苗、重组亚单位（颗粒）疫苗和核酸疫苗，不同类型的RSV疫苗对应的工艺流程有较大差别，本文分别总结了四种类型的RSV疫苗的工艺方案。

减毒活疫苗

减毒RSV疫苗的生产工艺可以 采用Vero细胞贴壁培养的方式进行病毒的扩增，Vero细胞的培养采用含10%血清的DEME培养基，感染结束后继续培养6天。收获的含病毒料液经过核酸酶处理，采用PreFlow UB预过滤器进行过滤澄清，然后经复合模式填料Capto Core 700纯化，以去除宿主蛋白及宿主核酸，此层析步骤的上样量可达10 CV （柱体积），相对于传统分子筛的常规上样量（0.01~0.05 CV）具有显著优势。Capto Core 700的流穿液采用500 KDa的中空纤维膜柱进行浓缩和换液，最后采用EKV无菌滤器进行除菌过滤。此工艺整体的回收率为50~60%，层析步骤的收率达到100%，宿主蛋白和宿主核酸的去除率达到99%以上，最终原液中每10 ng Vero宿主核酸病毒含量可达1.1 × 108PFU ，图2为减毒RSV疫苗生产工艺。

图2. 减毒RSV疫苗工艺方案

重组蛋白RSV疫苗

重组蛋白RSV疫苗的表达体系可以选择CHO细胞或昆虫细胞，以CHO细胞为例，细胞培养过程采用fed batch模式，细胞培养密度达10-14×106 cells/ml，表达滴度达1~3 g/L，此工艺步骤培养基可以选择ActiProTM基础培养基及Cell Boost™ 7a/7b补料培养基。培养结束后，采用两级的深层过滤以去除细胞碎片等杂质，深层滤器可以采用Stax™ Disposable Depth Filter PDP8/PDE2类型的深层滤器，然后经过0.2 µm过滤器过滤以降低微生物负荷。

澄清后的料液经过吐温80孵育进行病毒灭活，病毒灭活后的料液由亲和填料Capto DeVirs进行捕获，RSV Pre F蛋白可以与Capto DeVirs结合，大量的宿主蛋白流穿，经过高盐洗脱，蛋白得到提纯并起到浓缩的作用。第二步层析为离子交换层析，采用Capto Q ImpRes高分辨阴离子交换填料，结合洗脱模式用于去除宿主蛋白、宿主核酸，同时也是病毒清除的步骤。第三步为复合模式层析，使用的Capto Adhere填料兼具阴离子交换、氢键和疏水作用，采用结合洗脱模式，该步骤主要用于去除高、低分子量的产品相关杂质和宿主蛋白，另外，具有有效的病毒清除效果，对于MuLV可以降低4.81个Log，对于MVM可以降低3.15个Log。Capto Adhere洗脱液经过纳滤膜过滤以进行病毒去除，可以选用20 nm的 Pegasus™ SV4 系列滤器。然后再经过50 kDa的超滤膜包进行浓缩及缓冲液的置换，最后采用0.2 µm Supor EKV除菌滤器进行除菌过滤。图3为CHO细胞重组RSV疫苗生产工艺。

图3. 重组RSV疫苗工艺方案

mRNA RSV疫苗

mRNA类疫苗工艺包括了质粒模板的制备、mRNA的合成与纯化、LNP的制备及无菌灌装等步骤。质粒的制备工艺可以选择Cytiva的经典三步法工艺或改进两步法工艺（图4）。mRNA的合成工艺可以选择Wave或XDR一次性生物反应器进行酶促反应，优化的参数包括DNA模板、NTPs及RNase抑制剂浓度、离子浓度、酶活性、孵育pH、时间及温度等。mRNA纯化工艺一般采用Oligo dT亲和层析进行捕获，去除酶类、NTPs及模板DNA等工艺相关杂质，采用高分辨率的疏水或离子填料进行精细纯化，去除片段或dsRNA等产品相关杂质。

图4. 质粒工艺流程图

捕获层析除了用亲和层析，还可以选用复合模式层析填料Capto Core 700/400，葛兰素史克采用Capto Core 700用于自复制mRNA的纯化，相对于其他的工艺方案有更高的回收率及更低的杂质含量。此后，杜克人类疫苗研究所及伊利诺伊大学分别采用Capto Core 700作为mRNA捕获层析的平台工艺。相比于Oligo dT亲和层析，采用Capto Core 700复合模式层析具有如下优点：

1.载量高，填料使用量少，层析柱规格小；

2.层析缓冲液种类少，层析缓冲液总量少；

3.层析为流穿模式，工艺时间短；

4.层析填料成本更低；

mRNA形式的RSV疫苗依然可以采用Capto Core 700作为捕获阶段的填料，在可操作性及成本上都具有显著优势。精细纯化可以选择高分辨的疏水填料，如Capto Phenyl ImpRes或Capto Butyl ImpRes，或高分辨离子交换填料，如Capto Q ImpRes或Source 30 Q（图5）。

图5. mRNA RSV疫苗工艺流程图

病毒载体RSV疫苗

目前，用于RSV疫苗的病毒载体类型主要有腺病毒载体和痘病毒载体。已批准上市的腺病毒载体新冠疫苗已有较为成熟的生产工艺，以腺病毒载体疫苗为例，病毒生产工艺采用HEK293细胞培养和病毒的感染，细胞培养采用无血清悬浮培养基CDM4HEK293，感染结束后可以用表面活性剂对细胞进行裂解、核酸酶进行宿主核酸的降解，裂解液经深层滤器进行澄清。澄清后料液经300 kDa的中空纤维膜柱进行浓缩及换液，而后经过Capto Q ImpRes初步纯化及Capto Core 700精细纯化，层析后料液通过300 kDa中空纤维进行超滤浓缩和换液，0.2 µm Supor EKV除菌滤器进行除菌过滤得到最终的疫苗原液。工艺流程如下图6所示。

图6. 腺病毒RSV疫苗工艺流程图

总结：以上概述了四种类型的RSV疫苗的工艺方案，Cytiva可提供各个工艺步骤所需的耗材及设备，耗材包括培养基、填料、超滤膜包、预过滤器、除菌滤器、除病毒滤器及中空纤维膜柱，设备包括不同规模的Wave波浪式生物反应器、XDR一次性生物反应器、层析设备、超滤设备、配储液、核酸合成仪、完整性测试仪及无菌罐装设备等。图7为Cytiva在新型疫苗领域可以提供的产品，涵盖上游、下游及制剂等不同工艺流程，覆盖从实验室开发、中试放大到商业化生产的不同工艺规模。

撰稿人 | 正大天晴药业集团

责任编辑 | 胡静

审核人 | 何发

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