多肽固相合成常用树脂介绍

2023-02-09

近期发布的《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（征求意见稿）》中提到：固相合成中，树脂作为必需物料，其质量可直接影响多肽药物质量，应提供树脂的来源、质量标准和检验报告，并对树脂的摩尔取代系数、在不同溶剂中的膨胀系数、所用合成条件下的稳定性情况等予以说明。由于缺乏有效的表征手段和和针对性的质控方法，不推荐与肽链C端氨基酸相连的树脂作为起始物料。由此可见，虽然树脂在有些情况下不参与构成最终API的结构，但也应对其进行充分地研究。今天我就和大家简单介绍一下多肽固相合成中常用的树脂。

一、首先我们先要了解几个关于树脂的重要参数：交联度、目数、取代度、在不同溶剂中的溶胀度。

交联度：以PS树脂为例，它的树脂球是在聚苯乙烯中添加一定量的交联剂二乙烯基苯，经过聚合反应而成。交联剂二乙烯基苯的加入量就是交联度（DVB），树脂最佳交联度为1%，更高的交联度导致树脂溶胀度下降，然而较低的交联度会减小树脂在溶胀状态下的机械稳定性。一般来讲市售的树脂大部分都是交联度为1%的。

目数：树脂球的大小，一般市售树脂为100-200目(平均直径为75-150μm)，聚合反应的条件可以影响树脂球的大小。

取代度：每克树脂装载了多少毫摩尔的活性反应位点，单位是mmol/g。值得注意的是一般市售的Wang-resin，CTC-resin到手后，我们会在实验室装载第一个氨基酸，但这两种树脂的氨基酸装载率并不能达到100%，所以在此之后应该重新测定取代度。

溶胀度：树脂在不同溶剂中的溶胀能力，单位是ml/g。一般市售的树脂到手后，我们使用之前都需要用溶剂进行溶胀，良好的溶胀能够增加反应物进入位点的机会。DCM、DMF、N-甲基吡咯烷酮都是常用的良性树脂溶胀溶剂。

二、几种常用的树脂介绍

1、Wang-resin

多肽固相合成中常用的树脂，功能基团为羟基，第一个氨基酸通过酯键和树脂的Linker相连。因此偶联条件要比酰胺键剧烈，需要DMAP催化。由于DMAP碱性较强，特别容易消旋的氨基酸(Cys,His)不适合装载于Wang-resin，此时推荐使用CTC-resin。

此外，当Wang-resin碳端二肽中含有Gly、Pro时，还应注意DKP副反应，机理见图2。N-端氨基酸脱Fmoc后裸露出氨基，对前面的酰胺键或酯键亲核进攻，受影响的片段以二酮哌嗪的形式从树脂脱落，最终导致收率下降。当C-端前两个氨基酸中有Gly，Pro，N-烷基氨基酸，交替的D/L型氨基酸时会加速这一副反应。当使用的固定相的Linker类型为酯键时，这种副反应最为严重，因为比起氨基，羟基是一个更强的离去基团。使用CTC-resin可以抑制此副反应。

Wang-resin的linker比较稳定，需要高浓度TFA裂解。在高浓度TFA条件下裂解，Wang-resin的linker可能会发生不规则裂解产生正离子1，如果肽链中存在Trp残基，正离子可能会进攻Trp残基侧链的吲哚环引产生M+106的杂质，机理见图3。正常情况下，Wang-resin的linker在A处断裂，但是当肽链中含有一些难以脱除的侧链保护基时(如Arg的侧链Pbf,DOTA环的羧基保护基tBu等)，就不得不使用更强的切割条件，这时Wang-resin的linker就有可能发生不规则的裂解，在A和B处同时断裂，产生正离子1，这种离子特别容容易进攻Trp侧链。使用CTC-resin可以完全规避此副反应，如果一定要使用Wang-resin，可以降低切割温度，缩短切割时间来控制此副反应。

图1

图2

图3

2、CTC-resin

多肽固相合成中常用的树脂，对水极为敏感。装载第一个氨基酸时不需要预活化，直接把氨基酸和DIPEA的溶液加入树脂就可以反应，因此可以完全规避Wang-resin装载第一个氨基酸时产生的消旋副反应。同时，由于CTC-resin的linker上的氯原子的临位效应，也能够有效抑制DKP副反应。

CTC-resin的linker不稳定，低浓度TFA就可以使其裂解，因此在合成过程中可能会有部分肽链从树脂脱落导致收率降低，但也正因为这个特性，我们可以用低浓度TFA裂解肽树脂从而得到侧链全保护的多肽片段，用于多肽片段合成法。

CTC-resin

3、Rink amide-resin

最常用的用于制备肽酰胺的树脂，功能基团为氨基。通常我们使用的是氨基被Fmoc保护的Rink amide-resin，装载第一个氨基酸时应先脱除Fmoc,然后进入正常偶联洗涤脱保护的循环。Rink amide-resin的linker比较稳定，需要高浓度TFA裂解,因此也会产生和Wang-resin类似的副反应(见图5)。如果肽链中含有Trp残基，也应注意类似的副反应。

Rink amide-resin

图5

3、Sieber-resin

制备肽酰胺的树脂，价格比较贵。与Rink amide-resin一样，功能基团为氨基。通常我们使用的是氨基被Fmoc保护的Sieber-resin，装载第一个氨基酸时应先脱除Fmoc,然后进入正常偶联洗涤脱保护的循环。不同的是Sieber-resin的linker不如Rink amide-resin的稳定，可以用低浓度TFA裂解肽树脂从而得到侧链全保护的C-端酰胺化的多肽片段。