寡核苷酸原料药在常温下一般不稳定，有的在某些酶存在下也会发生降解。这就是为什么，它们使用特殊的递送溶液配制，例如脂质纳米颗粒 (LNP)。（这些递送技术还有助于核苷酸 API 进入靶细胞。）降解可能通过末端核苷酸或某些功能基团的丢失、氧化和其它机制发生。可以在较高浓度下发生的寡核苷酸-寡核苷酸相互作用是一个额外的问题。这些不稳定性问题必须在整个生产过程中得到管理。
信使 RNA (mRNA) 面临的挑战尤其巨大，信使 RNA 可能会被环境中常见的酶降解，并且还受到长链分子的整体剪切敏感性的影响。
Merck KGaA 生命科学业务 mRNA 解决方案战略营销经理 Julian Mochayedi 表示，基于核苷酸的疗法的前景基于这些模式半个多世纪的研究和开发。这些知识转化为临床及其它领域，市场上有几种已获批准的治疗产品。
Mochayedi 继续说道，不同类型的基于核苷酸的疗法可以根据核酸的类型进行大致分类，例如以 DNA 或 RNA 为基础的疗法。或者，它们可以通过决定作用方式的功能设计来区分。“人们可以引用基于 DNA 的腺相关病毒 (AAV) 载体进行基因递送、反义寡核苷酸 (ASO)、用于基因表达破坏的小干扰 RNA (siRNA)，以及最近用于表达目的蛋白质的mRNA，其可用于免疫目的，正如成功的基于 mRNA 的 COVID-19 疫苗所证明的那样，”他解释道。
Mochayedi 指出，基于 DNA 的寡核苷酸药物底物，例如质粒 DNA，具有 DNA 相对稳定的特征。较短的化学合成 RNA（如 ASO 和 siRNA）的稳定性可以通过合成过程中的化学修饰来提高。然而，生物合成的、特别长的 mRNA 分子本身就不稳定，因此在生产过程中需要额外的管理。
然而，所有基于核酸的平台都必须使用可保护治疗药物免于降解的递送技术来配制。LNP 等独特的解决方案有助于确保患者环境的稳定性、API 的稳定性，并最终确保治疗方法的有效性。
mRNA 固有不稳定性的原因有多种。导致其不稳定的单链 mRNA 分子的物理化学特性包括它们非常大的尺寸、高负电荷、对无处不在的酶（如核酸内切酶）快速降解的敏感性、剪切敏感性以及通过在溶液中形成二级结构而产生的高粘度。
导致 mRNA 降解的罪魁祸首之一是 RNase 酶。然而，要避免它很困难，因为这种酶无处不在。“mRNA 很难在环境中自由移动，”Vernal Biosciences 的首席执行官兼创始人 Christian Cobaugh 评论道。“因此，必须采取极端的预防措施，以避免将这种酶引入生产空间或外围，”他强调说。他指出，这个问题通常会成为没有 mRNA 生产经验的科研实验室进入 mRNA 市场的障碍。
Mochayedi 说，应该使用合格的工艺，包括无菌一次性技术，以减少核酸内切酶的污染和残留。Cobaugh 补充说，大量使用 RNase 降解化学品来清洁设备表面、操作员手套等也很重要。
根据 Cobaugh 的说法，室温下 mRNA 的不稳定性带来了进一步的挑战，因为在室温下保存制备的 mRNA 序列的时间相当有限。原料药必须无缝移动到下游纯化和制剂或快速冷冻。
“必须尽早考虑采用无缝生产方法或通过受控冷冻以及随后的解冻步骤而将单元操作分开的选择，因为该决定将影响 mRNA 生产设施的设计和操作，并且一旦实施，该设计将基本上将被锁定，”Cobaugh 说。
“理想情况下，最好限制冷冻和解冻步骤的次数，因为它们会影响 mRNA 原料药和配制的 mRNA-LNP 产品的质量，”Cobaugh 补充道。此外，必须采用温和的技术。将 mRNA 药物物质连续移动到纯化，然后再进行 LNP 配制，避免了除最后冷冻步骤之外的所有步骤。“不过，有可能通过正确的工程解决方案和验证程序来克服这两种 mRNA 生产方法所带来的挑战，”他总结道。
此外，Mochayedi 评论说，严格优化反应条件和关键单元操作的工艺参数，例如合成步骤（体外转录）以及过滤（通过切向流过滤）可以克服粘度挑战，并确保工艺过程中的低剪切，以保持生产过程每个阶段的 mRNA 的稳定性。“定制工艺开发和优化对于每个独特的 mRNA 序列来说都是必要的，以解决和克服突出的挑战，”他总结道。
Mochayedi 观察到，虽然利用 mRNA 来预防或治疗各种疾病的概念很简单，但事实证明，将这些脆弱的核酸安全有效地输送到细胞中，并在此转化为蛋白质，已被证明是一个巨大的挑战。“对于 COVID-19 mRNA 疫苗，解决这个问题的方法是开发 LNP。这些颗粒通常由四种不同的脂质组成（带正电荷的可电离脂质与 mRNA 带负电荷的主链结合，有助于稳定颗粒的聚乙二醇化脂质，以及有助于颗粒结构的磷脂和胆固醇分子），为脆弱的 mRNA 分子提供保护，使它们能够安全有效地输送到细胞中，”他解释道。
核苷酸 API 的结构对制剂辅料的选择有很大影响。此外，生产过程必须受到高度控制。“用于生产 LNP 的含有 mRNA 药物物质的缓冲溶液具有低 pH 值（通常是柠檬酸钠水溶液），这对核苷酸的稳定性施加了额外的压力，导致比在中性或弱碱性 pH 值下发生的分解更快，”Cobaugh说。
需要大约 4.5 的低 pH 值来电离 mRNA，以便它与脂质形成纳米沉淀物。Cobaugh 补充说，通常避免使用稳定加工助剂，因为它们会干扰 mRNA 的电离，并且还可能最终出现在产品中。此外，大多数能够稳定 mRNA、以防止 pH 介导的降解的分子可能是危险化学品。
因此，成功生产 LNP 的关键是最大限度地减少 LNP 生产过程所需的时间。Cobaugh 强调，这需要从质量源于设计的基础上对工艺有深入的了解，并结合全面的工艺验证。“绝对有必要深入了解可以从工艺和工程角度拉动哪些杠杆，以最大限度地减少配制过程各个方面的时间，”他说。
根据 Mochayedi 的说法，对于 mRNA 疗法和疫苗的灌装，通常与任何其它生物 API 没有什么不同。Cobaugh 表示同意，目标是灌装产品 - 无论是在无菌一次性塑料袋和容器中的药物物质，还是在无菌玻璃瓶中配制的药物产品 - 然后尽可能快地冷冻它们，但要以可控的方式进行。在这种情况下，挑战主要与工程和设备相关。
Mochayedi 说，对于 mRNA 的储存和运输，维持冷链、以确保其稳定性和完整性、一直到达患者的需求是最重要的。“中央存储通常在非常低的温度（-80 °C）下进行。同样，含有核苷酸的制剂需要在低温下运输，这通常使用干冰包装来实现，”他指出。在某些情况下，mRNA 药物产品可能需要添加冷冻保护剂来保护颗粒。调整赋形剂、以保护纳米颗粒也可能使一些制剂能够在大约 4 °C 下运输。
生产在较高温度下稳定的 mRNA-LNP 制剂是候选疗法和疫苗开发人员关注的重点。Cobaugh 指出的一种方法涉及开发更高质量的无断裂（通常称为缺口）的 DNA 模板，从而产生更短、更不稳定的 mRNA 序列。Mochayedi 指出了新型修饰核苷酸和新的加帽技术，以改变 mRNA 的物理形式，例如环状 RNA。“这些新方法可能会克服一些稳定性问题，并使 mRNA 作为技术平台得到更广泛的应用，”他认为。
mRNA 产品冻干作为冷冻的替代方法是另一个主要研究领域。“从理论上讲，只要不让水进入储存容器，冻干的 mRNA 产品就没有理由不能在室温下储存，”Cobaugh 说。他指出，这方面已经取得了初步的成功，他希望在不远的将来，冻干法能够应用于mRNA产品。
Mochayedi 对此表示赞同，并指出整个行业都在对制剂优化进行大量研究，以克服 mRNA 药品在运输和储存过程中的超低温要求，将配制的 mRNA-LNP 冻干是液体产品极有前途的替代方案。“通过冷冻干燥提供的完全干燥的制剂，将开启在温度更高的国家更容易地提供 mRNA 疗法的可能性，”他评论道。
原文：C. A. Challener, “Managing mRNA Instability During Formulation, Manufacturing, and Shipment,” Pharmaceutical Technology 46 (12) (2022).
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