一、 免疫动物
免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞。
说明:FCA,弗氏完全佐剂;FIA,弗氏不完全佐剂;Quickantibody,北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM,存在亲和力弱等缺点,慎用。
PS:1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原,每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时,如果抗原混有弗氏佐剂,建议注射在左侧腹腔,如果采用右侧腹腔注射,则在免疫过程中,很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况,造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后,应在96小时内完成细胞融合,否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合 (Cell fusion)
【材料和试剂】
(1)骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株,取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞,制备细胞悬液。
(2)免疫小鼠脾细胞悬液 取3天前加强免疫的小鼠,眼眶放血,分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠,浸泡于75%酒精中3~5min。无菌操作取出脾脏,置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤,剪去周围的结缔组织,将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上,先用剪刀剪成3~5个小块,然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中,加不完全培养液50ml,1000r/min离心5min,弃上清,再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中,计活细胞数,一般一只小鼠可得0.5~2×108 个脾细胞。
(3)饲养细胞 将小鼠致死、体表消毒和固定后,用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤,暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔,注意避免穿入肠管。右手固定注射器,使针头留置在腹腔内,左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟,随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟,弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮,根据细胞计数结果,补加HAT培养基,使细胞浓度为2×105/ml,备用。
(4)主要试剂的配制
①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM(Dulberco Modified Eagles Medium)两种基础培养基,配好后过滤除菌(0.22um),分装,4℃保存。
不完全RPMI-1640培养基:
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不完全DMEM培养基:
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用1N HCl调试PH至7.2-7.4,过滤除菌,分装4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基:
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HT或HAT培养基:
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②氨基喋呤(A)贮存液(100×,4×10-5mol/L)
称取1.76mg氨基喋呤(Aminopterin MW 440.4),溶于90ml超纯水或四蒸水中,滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和,再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20℃保存。
③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×,H:10-2mol/L,T:1.6×10-3mol/L)
称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2),加超纯水或四蒸水至100ml,置45-50℃水浴中使完全溶解,过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。④L-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100×,0.2mol/L)
称取2.92g L-谷氨酰胺(L-glutamine,MW 146.15),用100ml不完全培养液或超纯水(或四蒸水)溶解,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20℃冻存。
⑤青、链霉素(双抗)溶液(100×)
取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g,溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20℃冻存。
⑥7.5% NaHCO3溶液
称取分析纯NaHCO3 7.5g,溶于100ml超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),盖紧瓶塞,4℃保存。
⑦HEPES溶液(1mol/L)
称取23.83g HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N,-2-ethanesulfonic acid,N-2-羟乙基哌嗪- N,-2-乙基磺酸,MW 238.3)溶于100ml超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),4℃保存。
⑧8-氮鸟嘌呤贮存液(100×)
称取200mg 8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,MW 152.1),加入4mol/L NaOH 1ml,待其溶解后,加入超纯水或四蒸水99ml,过滤除菌;分装小瓶,-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中(即终浓度为20ug/ml)。
⑨50% PEG
称取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中,盖紧,60-80℃水浴融化,0.6ml分装于青霉素小瓶中,盖紧,8磅高压蒸汽15分钟,-20℃存放备用。临用前加热融化,加等量不完全培养基,用少许7.5% NaHCO3调PH至8.0,或购买Sigma或Gibco公司现成产品。
(5)24孔及96孔培养板等细胞培养所用材料和试剂。
【操作步骤】
PS:1、冻存的骨髓瘤细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态,培养目标是使处于对数生长的时间尽可能长。
2、饲养层细胞应在使的前一天制备好,这样才能分泌足够的细胞因子。
2、方法
(1) 将腹水用0.06 M醋酸钠(pH4.0)按1:3稀释,用1mol/L NaOH 调至血清稀释液为pH4.5。
(2)室温下边搅拌(磁力搅拌器 或电功搅拌器),边缓慢滴加辛酸(一般按每毫升稀释前的腹水加入40 ul正辛酸),滴加完后继续搅拌30min。
(3)4 ℃ 静置2 h。
(4)4 ℃10000 g离心20min,可见辛酸因温度低而从系统中结晶析出漂浮在腹水上层,用多层纱布过滤,弃去此结晶以及底部沉淀,收集上清夜。
(5)向上清中加入1/10体积的10×PBS(0.1M,pH 7.4)。
(6)4 ℃条件下,向其中加入饱和硫酸铵溶液,使终浓度为45%饱和度,静置1h以上。
(7)10000 g离心10-20min;弃上清,将沉淀溶于适量1×PBS中,再将其装入透析袋用10mM的tris或PBS透析(透析液应为抗体体积的100倍以上,最好搅拌),4 ℃过夜。
(8)收集透析好的抗体,直接现用或加入保护剂和防腐剂长期保存(-20℃保存或冻干保存)。
用这种方法纯化出来的抗体纯度可达80-90%左右,损失较少,对抗体的活性损失也较少,试剂成本低,但是操作比较费时。
3、蛋白含量测定
紫外分光光度法测样品在波长260nm,280nm处的I及收光度(A 260, A 280),蛋白含量按以下公式计算蛋白量(g/L)=(1.45 ×A280 -0.74× A 260)×稀释倍数
注:
1、单抗制备(小鼠)中的杂交瘤细胞是半贴壁型的细胞。
4、为防止细胞污染,通常用的抗生素有青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 ug/ml)、四环素(50 ug/ml)、庆大霉素(50 ug/ml),其中青霉素和链霉素联合使用较为常用,俗称“双抗”。
5、取少量分装的培养基加入至液体LB培养基里37 ℃培养过夜进行无菌测试(其它4 ℃保存),确认培养基无菌后才能使用。
6、LB培养基的配制:胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g 氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉 15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH(约0.2ml)调pH至7.2,121℃灭菌30min。
7、融合所用的瘤细胞是选择出来的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)缺陷细胞株,从而能有效地阻断瘤细胞DNA合成的外源性途径。
8、在瘤细胞利用磷酸核糖、氨基酸、CO2和NH3等化合物合成核苷酸过程中,叶酸是重要的辅酶,而氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂,可阻断瘤细胞DNA合成的内源性途径。
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本文的目的是为了探讨注射用甲苯磺酸奥马环素的无菌方法开发及验证。通过采用薄膜过滤法,使用1mol·L-1硫酸镁溶液对样品及所用培养基进行处理,pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液(含 0.1% 组氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐温 80)进行冲洗,有效地消除了样品的抑菌性。得出的结论为采用 1 mol·L-1 硫酸镁溶液及 pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液(含 0.1% 组氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐温 80)可以有效地消除注射用甲苯磺酸奥马环素的抑菌性能,可以将该方法用于注射用甲苯磺酸奥马环素的无菌方法验证。
作者:印萍
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