细胞疗法的最新临床研究进展

事实上细胞疗法早已用于患者来源的角膜缘干细胞修复受损的角膜上皮细胞、患者自体软骨细胞修复受损的关节、人工皮肤用于皮肤移植以及克罗恩病的干细胞治疗等。欧美临床应用的细胞疗法如表1所示；细胞疗法在癌症治疗中的临床研究进展：已不仅仅局限于血液/骨髓系统瘤或癌的治疗，而是拓展到了口咽/鼻咽癌、黑色素瘤、肝转移癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等实体瘤的临床治疗探索中，如表2所示；细胞疗法在非癌症领域中的临床研究进展：治疗领域已扩展至克罗恩病、多发性硬化、镰刀细胞病、黄斑性病变、淋巴增殖性疾病、GVHD(移植抗宿主疾病)、COVID-19、重症肌无力、I型糖尿病，如表3所示。

表1.欧美临床应用的细胞疗法

细胞疗法生产流程及各个步骤中面临的挑战

尽管近年来细胞疗法取得了显著的临床和商业成功，但它的商业化和广泛应用仍然面临着许多限制，如图1所示，包括如何确定合适的细胞来源，产生足够可行、安全有效和稳定的产品，以满足患者和疾病的需求。这些突破建立在数十年的基础研究之上，它们的成功以及其他前沿疗法的成功激发了许多跨学科领域的研究兴趣。尤其是细胞基因工程及生物合成将在下一代细胞疗法中有重要应用。

不同来源的细胞用于细胞治疗的优缺点如表4所示，这对于不同疾病治疗选用合适来源的细胞将非常重要。

工程学科的创新尤其是基因组/表观遗传编辑、生物合成及生物材料将为下一代细胞疗法的创新提供有力支持

基因组和表观基因组编辑、合成生物学和生物材料——目前正在进行探索，以解决细胞治疗中的重大挑战。虽然其中一些方法已经成功地用于生产商业化产品，但许多仍处于临床前阶段。

在治疗性基因组编辑和基于细胞的治疗的背景下，早期里程碑研究表明Cas9介导的BCL11A红细胞增强子的NHEJ可能用于治疗镰状细胞病或β-地中海贫血。此外，NHEJ策略使用Cas9来针对艾滋病毒的特定区域或人乳头瘤病毒(HPV)基因组在限制这些病毒的传播方面一直很有用。

使用Cas9mRNA和靶向T细胞受体(TCR)、β的gRNAs进行基于CRISPR-Cas9的多路基因组编辑2-微球蛋白(β2m)和PD1基因同时与慢病毒传递的CAR联合使用，生成了TCR、HLAI类分子和PD1缺陷的异体CAR-T细胞，并为通用的CAR-T细胞打开了大门。

基于CRISPR-Cas的HDR已被用于增加CAR-T细胞治疗的稳健性，通过将CD19特异性的CAR引导到T细胞受体α-chain(TRAC)位点，以获得更均匀的CAR表达和增强的效力。

人们使用核糖核蛋白(RNP)介导的CRISPR-Cas成分和设计供体模板，通过HDR将外源性有效载荷插入到原代人类T细胞中。这种方法允许强大的个体或多路修饰，并被用于纠正致病突变和工程内源性TCR位点来识别NY-ESO1癌症抗原。将这些方法扩展到将不同变异库敲入T细胞的特定位点，也被证明是一种筛选提高实体肿瘤疗效的有效方法。

基因组编辑在工程细胞的开发方面发挥了重要作用。例如，经过编辑以去除CD7和TRAC的人类T细胞显示出对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-all)的效力，而没有异种GvHD的证据。如上所，CRISPR-Cas9的多路应用也被用于同时破坏内源性TCR、HLA和PD1，以产生免疫原性降低的异体CAR-T细胞。

基于CRISPR–cas进行的基因编辑及基因表观遗传编辑可以用于提高细胞治疗效果，如图2所示，基因组和表观基因组编辑的结合推动了细胞治疗的发展。如上所述，这些新兴技术的发展可以进一步改善人类细胞治疗的疗效、安全性甚至是细胞治疗的应用范围。

近年来，合成生物学对细胞治疗的应用非常复杂，从工程蛋白质构建的简单开关模块到多组分“电路”——人工基因和蛋白质调节网络，通过编程将特定的分子输入转化为治疗输出。

CAR-T合成生物学最近的一个重要焦点是开发增强肿瘤靶向特异性的策略，以期使实体肿瘤治疗成为可能。synNotch系统就是一个著名的例子，最初被设计为在第二个配体存在的情况下表达CAR，从而实现抗原组合的双输入和门识别。synNotch的进一步发展产生了利用反馈来实现开关样激活的电路，在靶细胞抗原密度的阈值下全部或不激活，以及使复杂的多输入布尔门电路，有可能区分特定的肿瘤和旁观者组织。

其他提高CAR-T特异性的解决方案都集中在工程细胞外识别能力上，使用多价细胞外蛋白支架来介导抗原组合的识别。另一种系统为，其中一个工程蛋白在一系列抗原的存在下经历构象变化，以招募CAR-T细胞的肽。使 CAR-T治疗更安全的解决方案包括重新设计分裂受体，使其被诱导或通过小分子给药激活，两种策略都使CRS时CAR功能快速失活。

合成生物学的另一个主要焦点是开发可推广的闭环调节电路，用于监测生理或疾病状态特征，并与治疗输出产生反应。例如一种β模拟细胞已经设计出来，引入糖酵解Ca²⁺通路，以进行胰岛素驱动表达和分泌的转录回路诱导。

该领域的另一个持续焦点将是工程表面蛋白，以扩大细胞与环境相互作用的能力。例如骨髓间充质Cs瞬时表达编码PSGL1/SLeXX的单一转基因，SLeXX是一种在栓系过程中起关键作用的表面蛋白在炎症反应过程中，在小鼠皮肤炎症模型中显示了对炎症部位的定位增强。在另一项小鼠研究中，趋化因子受体CXCR4的过表达，增加了骨髓间充质干细胞对缺血心脏组织的归巢。

克服将复杂“电路”精确传递到治疗细胞的相互依赖挑战的解决方案将使合成生物学专注于开发具有多方面功能的程序，这些程序可以同时编码疾病特异性作用模式、安全机制和“电路”稳定性，同时建立和维护相关的细胞内在特性，如图3所示。释放合成生物学的全部潜力将需要克服目前对合成电路的大小的限制和相应的复杂性，这些合成电路可以有效地引入治疗细胞。

几种类型的免疫细胞在异体细胞的排斥中发挥作用，限制了真正的现成细胞治疗产品的发展。介导同种异体细胞排斥反应的免疫机制如图.4所示，需要细胞-细胞接触。因此，该领域的一个主要目标仍然是使用异体细胞，开发长期功能性免疫分离方案。

半通透性生物材料和水凝胶已被广泛的用于提高治疗性细胞的递送、活力、保留和安全性。生物材料配方已被探索作为支架，以提高输送和可行性，促进细胞滞留在一个特定的体腔内(即腹腔内, 心外膜或眼内)，促进受控释放, 并实现了可回收性，并提高了安全性。然而，由于宿主对植入的生物材料的免疫反应会导致设备内的纤维化和缺氧，因此被封装的细胞产物的长期功能一直难以捉摸。

图.4 克服同种异体细胞疗法免疫排斥的策略

许多策略已被用于调节生物材料的物理理化性质，以减少纤维化和促进移植物的长期存活。水凝胶表面已被免疫调节小分子修饰，以防止任何FBR(foreign body response)。在小鼠腹腔内使用铅材料植入，其化学结构中含有三唑框架的三种铅类似物、细胞、巨噬细胞和胶原沉积的FBR最低，这可能在减轻纤维化方面发挥重要作用。在小鼠身上观察到的阳性结果可转化为非人类灵长类动物。值得注意的是，该筛选的先导配方导致了SIG-001的开发，这是一个含有表达人类因子VIII的工程人类细胞的双室球体，最近进入了a型血友病的首次人体临床试验。

另一种有前途的缓解生物材料FBR的方法是使用超低污染的两性离子生物材料。蛋白质吸收被认为是宿主免疫激活和纤维化的关键协调因素。两性离子水凝胶创造了一个超亲水性的生物界面，以限制蛋白质的吸收。例如，超低蛋白污染、聚（甲基丙烯酸羧基甜菜碱）(PCBMA)水凝胶已被植入小鼠皮下注射，然后观察FBR和炎症反应。研究显示，PCBMA植入物周围的血管生成血管生长，同时存在大量的巨噬细胞，并显示出抗炎表达。

尽管封装已被证明在通过受体的适应性免疫反应阻止 MHC 介导的同种异体细胞识别和延长移植细胞的存活方面非常有效，但移植细胞的长期存活率是受限于封装生物材料的特征性异物反应 (FBR) 的发展。

目前有几个临床阶段的公司在推进用于1型糖尿病、内分泌学适应症和孤儿病的封装细胞产品。预计未来发展的封装细胞疗法，将与利用创新在基因组和/或表观基因组编辑和合成生物学一起，用于开发具有更长的寿命和增强感知和反应能力产品，为不同的疾病患者或不同阶段的疾病患者，提供更精确的空间和时间调节治疗方式。以便于监测、调节和报告患者生理学的波动，加强对内分泌或自身免疫性疾病等慢性适应症的管理。

参考文献：

Bashor CJ, Hilton IB, Bandukwala H, Smith DM, Veiseh O. Engineering the next generation of cell-based therapeutics [published online ahead of print, 2022 May 30]. Nat Rev Drug Discov. 2022;1-21. doi:10.1038/s41573-022-00476-6