冻融工艺在mRNA疫苗中应用
信使RNA（mRNA）是一类新兴的生物治疗药物，具有广泛的应用前景。mRNA理论上可以编码任何人类所需的蛋白质，不论是作为治疗性药物还是预防性疫苗。2021年，mRNA新冠疫苗全球销售额超过580亿美元，巨大的商业成功使mRNA技术成为全世界的焦点。目前mRNA技术已经在多个治疗领域取得开发进展，包括疫苗、蛋白质替代、细胞与基因疗法、局部再生疗法、肿瘤免疫治疗等。
我国mRNA疫苗的商业化进程更慢，但已有多家企业入局。复星医药从BioNTech引进的复必泰虽然国外已上市，但在国内的上市进程却很缓慢。尽管如此，2021年复必泰在港澳台地区的销售额也超过了10亿元。
虽然mRNA药物具有相当大的应用前景，但整个产业仍处于起步阶段，mRNA的序列设计和优化、mRNA的不稳定性、安全有效的体内递送仍然是mRNA疫苗开发和应用的重要挑战。
mRNA疫苗生产主要分为质粒DNA生产、mRNA原液生产和mRNA制剂生产三个环节。整个工艺的核心和基础是质粒DNA转录模板的序列设计，目前主流采用E.coli作为工程菌，通过发酵培养来实现DNA扩增。
因此，质粒DNA生产的主要工艺为：E.coli菌种库复苏à发酵扩增培养➩收获裂解➩澄清过滤➩超滤浓缩➩层析纯化➩浓缩换液➩质粒DNA线性化➩超滤纯化➩除菌过滤➩分装冻存。虽然质粒DNA生产所用工艺技术为行业现有技术，但当前质粒DNA生产成本仍然较高，这一方面是由于质粒表达水平不高，只有300~1000 mg/L，另一方面是由于质粒DNA为胞内产物并mRNA制备需要线性化的、特定长度且高纯度的质粒原料，这使得下游纯化路线较长，收率只有30~40%。
mRNA原液生产以线性化质粒DNA为转录模板，通过酶促多聚反应合成mRNA分子，属于无细胞体系的生物合成，因此相比于传统微生物或细胞培养反应，具有工艺过程简单、反应时间短、纯化收率高、生产成本低等优势。mRNA制备的主要工艺为：体外转录➩转录后化学修饰➩DNA酶处理➩层析纯化➩超滤浓缩换液➩原液除菌过滤➩分装冻存。mRNA的纯度对于其安全性和有效性非常重要，因为杂质含量会影响到mRNA的翻译效率和免疫原性。另外，由于mRNA的稳定性较低，冷冻保存过程也可能导致新的杂质产生。
mRNA最终制剂的生产是当前挑战最大的环节，主要在于递送系统的选择、工艺控制、供应链和专利限制等。mRNA原液的复融可能是被忽略的工艺环节，但复融过程中的重结晶可能是导致mRNA失活的重要原因之一。当前在研的递送载体包括脂质类、聚合物类等，但主流仍然是纳米脂质颗粒（LNP）。将mRNA用LNP包封的方法也很多，当前的主流是采用微流控技术，通过高速的两相混合形成包封复合物。mRNA-LNP包封后经过越滤纯化、除菌过滤、无菌灌装和包装，即成为最终mRNA疫苗制品。超低温冷冻保存和运输也是当前mRNA疫苗应用的挑战之一。
为了给全球mRNA疫苗，尤其是新冠疫苗的生产和质控、非临床和临床评价等提供信息和法规监管指导，WHO于2021年10月正式通过了指南文件“Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations”。
指南在6.8.2节指出“应特别注意尽可能减少mRNA在包封过程中以及在生产条件下的降解，尤其是那些已知的会影响LNPs和最终mRNA-LNP疫苗产品稳定性的因素（比如，mRNA的复融，LNPs或mRNA-LNPs的冷冻速率）。
指南在第6.8.4.5节指出mRNA在LNP的包封率应作为关键质量属性之一，因为未包封的mRNA是不稳定的。应确认最终产品的结构不会因为冻融循环和稀释而改变。
具体现有mRNA疫苗的厂家都在哪些环节对冻融进行了研究？
以下分析内容节选自EMA公布的某COVID-19 mRNA疫苗上市申请评估报告。
申请人提供了mRNA活性物质的详细表征，包括mRNA CX-024414结构特性的详细信息。此外，还提供了色谱图、热变性和冻融降解及其对蛋白表达的影响数据。
评：该企业向监管机构提供了冻融降解的数据，以及冻融对蛋白表达的影响数据。
提供了全面的开发数据，描述了在开发过程中所做的变更，包括规模放大、增加原液冷冻步骤、一些设备变更和脂质摩尔比调整以匹配平台工艺。
评：该企业在生产工艺开发过程中，增加了工艺放大过程，原液生产出来后，增加原液冷冻步骤，确保工艺的一致性。
LNP 生产工艺包括脂质原料溶液 (LSS) 制备、纳米沉淀混合、切向流过滤 (TFF)、稀释和冷冻保护剂添加、澄清、灌装以及冷冻和储存。
评：在生产工艺中冷冻和存储是分开的，产品经冷冻后存储。工艺步骤必须关注批次间和批次内的均一性，冷冻速率是关键参数之一。
使用开发批次进行了支持装载mRNA的LNP中间体冻融循环的稳定性研究。结果表明，mRNA-1273 LNP生物物理属性（粒径、多分散性、封装）不会受到不同冻融过程（室温或 2~8°C）或 5 个冻融循环的影响。
还进行了支持成品冻融循环的稳定性研究。冻融循环重复了多达五次。所有结果都在标准范围内，表明最终产品在反复冻融中相对稳定，支持五次冻融循环。然而，批准上市的产品信息中显示，成品不允许反复冻融。
评：采用经优化的冻融工艺，中间体和成品可以耐受反复冻融，使产品质量不受冻融循环的影响。
RT-PCR分析经过了可接受的验证，并提供了额外的验证研究，以评估临床样品在各种温度和冷冻/复融循环中的稳定性，以涵盖运输和储存条件。
评：在临床阶段做的冻融稳定性实验，涵盖运输和存储，也说明冻融实验的关键。为后期上市做准备。
该公司在冻融工艺的开发过程中，和SUS进行了紧密的合作。SUS根据此公司的特定工艺要求，开发相应的冻融曲线和工艺方案。
冻融过程从多个方面对mRNA分子形成压力，工艺优化的目标是减少这些压力的影响，包括：
尽可能减少冷冻浓缩带来的浓度影响。
尽量减少PH漂移给mRNA分子带来聚集的发现
减少mRNA与冰液界面相互作用
▲ 不可控冷冻导致冷冻浓缩（左）和可控平板冻融实现均一冻结（右）
经验丰富的mRNA公司会选择尽可能快地冷冻mRNA，某公司要求在5小时内从液体冷冻到-60°C。以下是SUS公司为该mRNA公司提供的工艺摸索条件：
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Fastest Feezing to -60℃(H)
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▲ 不同冷冻保护壳（1059&1008）和装量的冷冻数据
SUS公司专注于下游到灌装之间的解决方案，产品涵盖袋子保护壳RoSS、分装设备RoSS.Fill、冻融设备RoSS.pFTU、运输箱体RoSS.Ship等。
RoSS保护壳的专利技术，完美保护了袋子的安全；
RoSS.Fill快速精确分装，超高灵活性和安全性；
RoSS.pFTU冻融设备大容量，超低温，完美的冻融曲线；
RoSS.Ship 超长的保温时间和超高安全的运输方式。
现在RoSS.Fill分装系统和冻融系统在全球已经超过200多个用户。
研熠作为SUS在中国的合作伙伴，提供SUS产品的技术咨询、产品销售和技术服务等。
总而言之mRNA是不太稳定的产品，在产品开发阶段、临床阶段，工艺放大阶段都需要对冻融展开充分研究，确保合适的配方，在后续放大生产需要根据之前积累的数据，进行可放大的冷冻和解冻，使之在整个生产工艺能按照之前开发的产品特性保持一致的同时，提供产品的得率。
1.Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations WHO October 2021
2.Assessment report-COVID-19 Vaccine ModernaEMA，11 March 2021
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