无菌制剂根据生产工艺，分为最终灭菌产品和非最终灭菌产品。对于最终灭菌产品，法规未强制要求模拟试验。但对于非最终灭菌产品，必须进行无菌工艺模拟 (aseptic process simulation，APS) 试验^[1]。无菌工艺模拟试验，又称培养基模拟灌装试验，是评估非最终灭菌产品无菌生产工艺的有效方法之一 ^[2-3]，一直是 GMP 符合性检查的重点。《无菌工艺模拟试验指南 ( 无菌制剂 )》^[3] 定义无菌工艺模拟试验如下 ：采用适当的培养基或其他介质，模拟制剂生产中无菌操作的全过程，以评价该工艺无菌保证水平的一系列活动。

无菌工艺模拟试验应尽量采用和实际生产工艺相同的条件、操作方法、生产环境，模拟无菌界限内所有影响产品无菌性的关键操作 ^[4]，从而真实、可靠地反映工艺。本文分析无菌工艺模拟试验设计流程，结合 GMP 检查中的关注点，通过要点分析和案例研究，以期对无菌工艺模拟试验的设计和实施提供一定的参考。

无菌工艺模拟试验的流程如下。识别无菌工艺模拟试验的起点→确定模拟频次和批量→最差条件选择→实施→培养与观察→促生长试验→结果评价及运用。

《无菌工艺模拟试验指南 ( 无菌制剂 )》^[3] 明确规定，无菌工艺模拟试验应从无菌操作 ( 无菌工艺 )的第一步开始，直至无菌产品完全密封结束。若产品制备阶段采用了无菌工艺，也应作为模拟试验的一部分。全程无菌生产 ( 如配制后不能除菌过滤 )的产品，无菌工艺模拟试验应涵盖原液配制、半成品配制等所有无菌操作过程，在某些情况下，还包括容器密封后对生产容器完整性产生不利影响的检测或处理等步骤，如泄漏检测、自动检测等。因此，设计非最终灭菌产品无菌工艺模拟试验的起点时，应从产品特性和生产工艺出发。

无菌工艺的模拟试验一般要避免对单元操作分别模拟，应尽量进行连续工艺模拟。任何单独的模拟均需有文件记录，并确保所有单独模拟的总和能持续且全面地覆盖整个工艺 ^[4]。单元操作模拟的合格标准判定需来自各单元操作的累积，并应考虑整个过程中发生的微生物总数。

新的无菌生产线，在正式生产之前，至少应完成连续 3 次成功的无菌工艺模拟试验；而正常生产期间，每半年进行 1 次试验，每次至少 1 批 ^[5]。如因其他原因停产一定周期的生产线，在恢复正式生产前应进行无菌工艺模拟试验。例如 ：发生空气净化系统、生产用设备、厂房改造、无菌生产工艺及人员的重大变更，或设备的重大维修后，应进行无菌工艺模拟试验。模拟批次应基于对无菌风险影响的重要程度来决定，对无菌风险造成中、高等级影响的变更或维修，建议应进行连续 3 批无菌工艺模拟试验。

无菌工艺模拟试验的批量在《药品生产质量管理规范》(Good Manufacturing Practice for Drugs，GMP) 附录 [5] 和美国注射剂协会 (Parenteral Drug Association，PDA) 发布的技术报告 [6] 中均有相应描述，并且要求基本一致 ：生产批量小于 5 000 支，模拟支数至少应等于生产批量 ；生产批量在 5 000 ～10 000 支，则模拟支数应与生产批量相当 ；生产批量大于 10 000 支，模拟支数应大于 10 000 支。在遵循上述原则的前提下，还应考虑分装足够的支数以覆盖所有干预操作。

无菌工艺模拟试验应选择合理的“最差条件”。通过最差工艺条件对工艺流程、设备和整个体系进行挑战，在最差条件下的合格结果能证明无菌操作的可靠性，从而保证产品的无菌可信限度达到合格标准。但最差条件并不意味着人为创造超出允许操作、强制系统失败的条件，最差条件应取决于影响产品无菌性的操作或正在考虑的风险，包括但不限于以下 4 个方面。

此外，迎检过程应特别关注无菌室操作人员进入无菌生产核心区域的细节，包括人员更衣进出洁净区的单向流移动或分时移动 ^[9]，人员在洁净区的站姿、坐姿、手消频次、行走速度，以及物品进入B 级背景下 A 级区域的转运、脱包和消毒 ^[8]。

无菌操作过程中的时限挑战可考虑以下方面，如灌装系统组装的最长时间、灌装最长时间、冻干产品轧盖最长时限、故障维修最长时间、开安全门最长时间、操作人员最长疲劳时间。

无菌工艺模拟试验中的干预设计应基于日常生产时的干预项目和次数的统计。通常情况下，常发生的干预应每次模拟，不常发生的干预可定期模拟。干预模拟的次数应不低于实际生产中干预发生的次数，但也不应过度模拟。

另外，环境监测本身也是一个干预，可通过模拟灌装来判断环境监测的有效性和科学性，后期也可通过环境监测判断模拟灌装失败的原因。例如，培养基模拟灌装时发生粒子报警，应按照日常生产时的报警处理方式进行调查和说明，并进行记录。因模拟各种干预操作，可接受悬浮粒子报警的频次高于日常生产。对于人员进入 A 级区进行干预操作的情况，除对人员五指进行取样外，还应对其他部位进行表面微生物取样。

无菌工艺模拟试验结束后，应对所有与培养基接触的设备、容器、部件及环境进行有效清洁，防止培养基残留造成的微生物滋生，并对设备进行清洁效果确认。灌有培养基的容器可用于微生物侵入试验，以证明容器密闭完整性。培养基灌装后容器具清洗效果的确认频次以及容器密封性的确认频次，仅需在非最终灭菌产品的首次无菌工艺模拟试验中进行，后续无需每次都进行周期性验证。若清洗程序或包材组合发生变更，则需再次确认。例如 ：清洗条件、流程、方法发生变化时，应进行清洗效果确认 ；内包材规格、厂家、组合形式发生变化，应进行微生物侵入试验。

灌装的培养基在培养前应进行倒置或相关操作，以确保培养基接触到密闭容器系统的所有内表面，培养时间至少为 14 d，温度应保证微生物能够繁殖，一般在 20 ～ 25 和 30 ～ 35 ℃环境中分别培养不少于 7 d，期间对温度进行控制和连续监测。由经过培训且具有资质的人员对所有无菌工艺模拟试验中灌装的培养基逐支进行无菌性检查 [4]，若在培养期间发现异常情况 ( 如瓶身破裂、长菌等 )，应记录并做进一步调查。每次无菌工艺模拟试验均应录制视频并妥善保存，视频监控录像属于文件记录的一部分，需包含所有高风险操作和关键信息 [4]。作为历次检查的重点，检查员异常关注高风险操作人员无菌操作的规范性、模拟试验与产品实际生产工艺的一致性、视频和记录的一致性等。另外，若无菌工艺模拟试验失败，监控视频是调查失败原因的重要途径。

虽然通过培养基模拟灌装试验可评估无菌生产工艺的可靠性，但当产品无菌检查时发现阳性结果，不能以模拟灌装试验结果排除生产过程带来污染的可能性。

对于无菌生产人员，企业应建立资质获取和取消流程，获取资质需满足洁净室更衣标准要求，完成相关的培训，参与一次成功的无菌工艺模拟试验。通过无菌工艺模拟试验结果确认每位参与者可进入的区域及其允许的无菌操作项目 ^[11]。对于不符合无菌室工艺操作流程或职能相关要求的，或者因自身行为导致其参与的无菌工艺模拟试验失败，应取消无菌操作资质，相关人员在克服问题、重新培训直至表明具备无菌生产能力后方可重新获取资质。

以某一冻干产品为例，对无菌工艺模拟试验的关键设计要点进行说明。产品生产工艺流程如图 1所示。

该产品在原液制备阶段也有除菌过滤操作，且有取样进行无菌检查的步骤。根据现有检查的趋势，将产品原液制备阶段也纳入无菌工艺模拟试验的范围。因此，该产品的无菌工艺模拟试验是从单次病毒收获液合并这一步开始模拟。

原液制备和半成品配制的无菌工艺模拟试验操作流程按照产品生产工艺流程进行，包括过滤和取样的操作步骤。以下以制剂分装阶段为例，从模拟条件和干预项进行方案设计。

针对此类问题，本研究制定干预操作管理文件，对干预项目的设计原则进行规定。要求每次无菌工艺模拟试验前，统计自上一次成功的无菌工艺模拟试验以来，生产过程中发生的所有干预。对于生产时发生超出上一次模拟次数的情况，进行原因说明和风险分析。若是因包材质量问题或人为操作问题造成的干预次数超标的情况，制定预防纠正措施，但不纳入新一次模拟的次数增加，以避免过度模拟 ；若在正常、合理的情况下，干预次数超出上一次模拟次数，则在上一次干预模拟次数的基础上增加 10％左右，作为新一次的无菌工艺模拟试验干预次数模拟值。本研究按照该原则进行干预项目和次数设计，在外部审计时也得到认可，期望为相关企业提供一定的参考。

目前，我国已正式申请加入国际药品检查合作计划(Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme，PIC/S)^[12]，对我国的药品检查制度和标准提出了更高要求。为更好地适应未来新形势下无菌药品 GMP检查工作，有效提升非最终灭菌产品的生产质量管理水平，一方面，企业在实际生产过程中应深入学习和理解相关法规，持续更新管理理念，以缩小在无菌保障方面存在的差距 ；另一方面，应更全面、科学地设计无菌工艺模拟试验，提升产品的无菌保障水平。建议企业对日常生产过程中发生的干预情况进行统计和分析，通过最差条件模拟，更客观地评价工艺的无菌保障水平，从而完善无菌工艺控制策略，提高无菌保障水平，保证产品的安全性、有效性和稳定性 ^[13]。