生物制药代表了多种类别的药品，这些产品已发展到涵盖使用重组 DNA (rDNA) 技术由活体生物体生产的任何生物产品，包括重组蛋白疗法、疫苗以及细胞和基因疗法 (C>) 。在过去的四十年中，已有 300 多种生物制药产品进入市场，2015 年至 2018 年 7 月期间有 100 多种产品获得批准。与小分子药物相比，这些产品的生物起源可以为治疗多种适应症（例如癌症、自身免疫性疾病、遗传性疾病或传染病）提供新颖的作用机制，目前可用的治疗性重组蛋白包括激素和生长因子到干扰素和酶。尤其是单克隆抗体 (mAb) 作为治疗方法的快速增长，因为它们能够以高亲和力和特异性结合靶标，然后激活免疫系统，这是小分子难以实现的任务。仅 2021 年，就有 115 种单克隆抗体进入临床，主要用于肿瘤适应症。在 2019 年最畅销的 20 种治疗药物中，有 9 种是单克隆抗体，总共带来了 750 亿美元的收入，其它几种潜在的重磅单克隆抗体也于 2020 年获得批准。2021 年 4 月，美国食品和药物管理局 (FDA) 批准了第 100 个 mAb，距离批准第一个 mAb 已过去 35 年，预计到 2025 年，mAb 市场将达到 3000 亿美元。在过去五年中，C> 的监管批准为以前难以治疗的疾病创造了个性化的治疗方案，并可能提供长期治疗。

虽然使用 rDNA 技术生产的治疗方法直到 20 世纪 80 年代才开始惠及患者，但猪源胰岛素和脊髓灰质炎病毒疫苗等生物制品已经很成熟。这些早期产品主要源自动物组织、血清或原代细胞系，这些生产平台固有的可变性导致产品纯度和功效与当今的标准相比较低。利用现有生产工艺中的知识在生物制药行业的快速增长中发挥了重要作用，当今使用的单元操作受到二十世纪上半叶建立的技术的影响，其中许多技术基于化学工程师熟悉的基本原理进行操作。这些基础技术的逐步改进催生了现代生物制药工艺，设定了一致性和可重复性的新标准，从而提高了产品功效、质量和安全性。

生物制药产品的一般生命周期始于发现，在此期间生成数千个初始候选分子，并筛选针对选定生物靶标的活性。表现最好的候选药物经过优化，以提高体外和体内的功效和安全性测试。选择用于人体进一步研究的产品将进入工艺开发 (PD) 小组，该小组负责开发所需的生产工艺，以足够的规模生产材料，以供应临床试验并最终满足商业需求。本文将综合性介绍 PD 和重组蛋白疗法生产的历史视角，并强调了使该行业达到当前状态的关键进步，特别是细胞系开发、上游细胞培养和下游纯化工艺，最后是原料药（图1）。药品生产和产品稳定性虽然对行业至关重要，但本文将不做讨论，因为已在其它文章中进行了综述。虽然重组蛋白产品组合涵盖多种蛋白类别，但对单克隆抗体的巨大经济需求推动了整个生物制药行业的生产和工艺改进，单克隆抗体研究成果也应用于其它产品。由于它们对生物制药行业的增长和方向产生深远影响，本次综述主要关注单克隆抗体生产领域所做的工作。

图1生物制药生产的著名里程碑和革命性的发现，包括上游技术进步(黄色)、下游技术进步(蓝色)和行业里程碑(绿色)。缩写：cGMP，现行良好生产规范；CHO，中国仓鼠卵巢;CIP，在线清洗；DHFR，二氢叶酸还原酶；GS：谷氨酰胺合成酶；mAb，单克隆抗体；tPA，组织纤溶酶原激活剂。

行业的出现：赋能技术和早期工艺（∼1960 年代–1989 年）

产品发现和优化：利用重组 DNA 技术

rDNA 技术的出现使科学家能够组装来自不同生物体的 DNA，以生成新的基因结构并将其传递到所选的细胞宿主中，为发现、工程和生产生物制药创造了前所未有的新方法。为了获得目的产品，科学家们不再需要依赖来自动物的原代细胞，其中许多原代细胞难以分离，难以大规模生长，产生的产品数量低，并且本质上是可变的。相反，rDNA 技术为科学家提供了在细胞类型中生产类人蛋白质的机会，这些细胞类型更容易大规模生长，并产生足够的产品来满足日益增长的药品需求。1979 年，Genentech 使用 rDNA 技术在大肠杆菌中成功生产人胰岛素，这标志着 rDNA 的首次重大应用，证明具有治疗潜力的人类蛋白质，甚至是异二聚胰岛素等复杂蛋白质，可以在非天然宿主中生产，并成功纯化至生成具有良好功效和安全性的功能性药品。积极的临床试验数据支持 FDA 于 1982 年 10 月批准了第一个重组人胰岛素产品，这是一个里程碑式的决定，标志着重组生产的生物治疗药物被接受，并开创了生物制药行业的新时代。使用大肠杆菌生产平台的其它蛋白质类别的新重组疗法迅速获得批准 - Genentech 继胰岛素成功之后，于 1985 年获得重组人生长激素的批准，并有两种重组干扰素于 1986 年获得批准。

rDNA 技术在抗体疗法的商业化中也发挥了至关重要的作用，因为它们使得能够通过杂交瘤技术同时发现和生产 mAb，该技术于 1975 年首次发表。抗体疗法已经使用了几十年，但它们依赖于来自许多捐赠者（人类或动物）的混合血清样本的多克隆抗体，这产生了来自许多 B 细胞群的抗体结构的可变和异质混合物，这很难表征。Köhler 和 Milstein 的杂交瘤方法提出了一种制备单克隆抗体的方法，即源自同一 B 细胞的化学成分相同的抗体。杂交瘤技术的可重复性是广泛实施抗体疗法的关键：一旦建立了杂交瘤细胞系，就可以通过细胞培养可靠地产生一种具有明确结构和已知功效的抗体。早期杂交瘤可用于生成用于临床诊断和基础免疫学研究的 mAb，但是当 1979 年发现了三种针对 T 细胞表面抗原的 mAb 时，研究人员意识到这些抗体也可以用于治疗目的。其中一种 mAb 的临床试验表明，它是一种有效的免疫抑制剂，可对抗移植后的急性器官排斥，而 Orthoclone OKT3 muromomab-CD3（该产品最终被命名为 Orthoclone OKT3 muromomab-CD3）是第一个商业化的 mAb 产品，也是第一个使用杂交瘤技术开发的产品。

早期的杂交瘤培养物源自小鼠细胞系并产生类似小鼠的抗体，其结构与人类抗体的差异足以给早期的单克隆抗体产品带来两个主要问题：第一，小鼠抗体不容易被人类免疫系统识别，第二，它们可以引发患者的免疫反应，从而产生人抗小鼠抗体 (HAMA)。有关 HAMA 反应的报告早在 1983 年就已发表，并强调需要改进抗体框架，以降低患者的免疫原性，并改善效应器功能。使用 rDNA 技术，嵌合方法，将鼠源可变区融合到人免疫球蛋白恒定区，以及人源化，将鼠源互补决定区移植到人可变区，以解决这个问题，同时建立对于mAb产品通用框架。1989 年建立的聚合酶链式反应技术可直接从原代细胞或杂交瘤细胞中获取抗体基因，扩展了现有的抗体基因分离和工程技术。这项新技术的意义尤其深远，因为获得的抗体序列可以使用替代细胞平台进行表达和亲和性筛选，然后根据需要进行工程设计，以降低免疫原性或改善功能。这些发现最终催生了噬菌体展示和重组生成的体外文库等方法，这些方法进一步发展成为当今用于抗体发现的平台。直接从发现平台获得抗体序列或表达载体还使得能够在更适合大规模生产的宿主中更容易地制备抗体生产细胞系。

细胞系开发：CHO 细胞的出现

许多早期的生物制药产品依赖于大肠杆菌 K12 菌株，该菌株经过精心设计，可以最大限度地减少或消除对患者的任何风险，但细菌系统无法可靠地大量生产可溶性哺乳动物蛋白。为了最大限度地提高产量，微生物工艺需要从包涵体中提取、重新溶解和重新折叠目的蛋白质，从而增加了工艺的复杂性。缺乏所需的酶途径和类哺乳动物糖基化的区室化也限制了使用微生物宿主生产的蛋白质类型。因此，能够安全有效地产生大量具有类人翻译后修饰的蛋白质的哺乳动物细胞系的出现对于生物制药行业的发展至关重要，其中Genentech的组织纤溶酶原激活剂（tPA）是在中国仓鼠卵巢悬浮培养中生产的，而Amgen的促红细胞生成素（EPO）是在贴壁 CHO 细胞中产生的，作为确立 CHO 生产的治疗性蛋白的安全性和有效性的里程碑。

1958 年，Puck等人首次分离培养CHO细胞，用作遗传研究的模型细胞系。Puck等人观察到，从中国仓鼠 (Cricetulus griseus) 卵巢组织中获得的贴壁细胞“特别坚固且可靠”，可连续培养 10 个月以上，形态上没有明显差异。CHO 细胞的染色体数量相对较低 (2n = 22)，Puck 的团队在最初 10 个月的培养过程中没有观察到核型发生变化。中国仓鼠来源的细胞的强大性能推动了进一步的表征和克隆，包括 1968 年熟悉的 CHO-K1 细胞系的衍生。重要的是，CHO 细胞适应了悬浮细胞培养（CHO-S，1971 年产生），使它们能够在搅拌罐生物反应器中大规模生长，并经过修饰，以产生具有有用代谢缺陷的细胞系，用于营养缺陷型选择系统，例如作为二氢叶酸还原酶（DHFR）/甲氨蝶呤系统。创建了两种支持转基因高表达的 DHFR 活性缺陷的 CHO 宿主细胞系（1980 年产生的 CHO-DXB11 和 1983 年产生的 CHO-DG44），再加上 CHO 强劲的生长特性，使这些细胞成为对不断发展的生物制药行业有吸引力的宿主。

上游工艺开发：利用已建立的工艺知识

使用贴壁细胞系和悬浮细胞系的大规模哺乳动物细胞培养工艺的大部分基础工作是用于牲畜病毒疫苗、人干扰素或抗生素的非重组生产，并且这些行业的原理被早期生物制药行业应用于细胞培养生物反应器。

为了给贴壁细胞提供必要的生长表面，早期工艺使用滚瓶，其中部分填充有培养基并缓慢旋转，使细胞粘附。通过简单地增加所用瓶子的数量来扩大这些工艺的规模是很简单的，但增加产量还需要增加工厂空间并调整现有方案，以适应更多的瓶子操作。微载体培养技术使细胞在悬浮基球的表面生长，为贴壁细胞系的生长提供了一种替代方法，并于 1975 年首次在工业上使用。微载体培养将搅拌罐的便利性与细胞所需的粘附表面相结合；然而，第一代微载体将细胞暴露于高水平的搅拌、泡沫和剪切力下。

生物制药行业从贴壁哺乳动物细胞培养向悬浮细胞培养的转变是由市场对重组蛋白治疗药物数量不断增长的需求推动的。例如，组织纤溶酶原激活剂所需的高剂量导致 Genentech 将贴壁生产 CHO 细胞系改造成悬浮培养，最终达到 10,000 L 规模和 50 mg/L 的滴度；然而，由于专用培养基配方的可用性有限，最初使 CHO 细胞适应悬浮培养具有挑战性。生产单克隆抗体的杂交瘤的优点之一是它们可以在悬浮培养中生长而无需驯化，因此，优化这些工艺对于早期单克隆抗体生产商达到预测市场需求所需的数量至关重要。为了理解和模拟悬浮杂交瘤培养的生长和代谢动力学，行业做了大量工作，比较了基因扩增策略、补料成分、代谢需求和生物反应器模式对滴度的影响，这些研究推动了细胞培养生产率的稳步提高。由于担心细胞的剪切敏感性，一些杂交瘤工艺选择使用气升式生物反应器，这种设计中气体通过导流管通气，作为培养液循环的机制，规模高达 1,000 L。生产商最终意识到哺乳动物细胞比最初怀疑的更能耐受高剪切，并且哺乳动物细胞培养采用了许多类似于微生物发酵的技术。搅拌罐生物反应器中的补料分批工艺成为使用杂交瘤生产 mAb 的首选模式，到 20 世纪 90 年代初滴度达到 >1 g/L。随后，PD 小组将重点转移到更好地了解将哺乳动物细胞培养工艺提高到 10,000 L 规模以上所需的放大和控制参数，再次使用非重组生物产品的工艺作为先例。

改进的培养基配方的开发对于实现重组蛋白生产所需的高密度悬浮细胞培养至关重要。许多哺乳动物细胞类型需要添加动物血清，通常是胎牛血清，但动物源性产品具有固有风险，包括不确定的可变性和外来因子（病毒或传染性海绵状脑病）的传播。第一个无血清培养基配方（Ham's 营养混合物 F12）于 1965 年发布，用于扩增克隆 CHO 细胞，但不适合达到大于 1 × 10^5 cells/mL 的细胞密度。Murakami 于 1982 年确定了四种用于替代血清的基本细胞培养添加物（胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和硒，统称为 ITES），改善了无血清培养基的性能，并与 ITES 添加物结合持续改进了营养水平，推动了广泛使用的富集 RDF 培养基配方，于 1985 年发表。富集 RDF 基础配方构成了许多早期哺乳动物细胞培养基的基础，并已被生物制药界逐步优化。

下游工艺开发：改进层析填料

分配层析法于 1941 年首次被描述，但由于 20 世纪 50 年代之前缺乏合适的填料基质，其在蛋白质等大分子中的应用最初受到限制。20 世纪 50 年代末和 60 年代初，多孔亲水基质（例如基于纤维素和葡聚糖的离子交换 (IEX) 介质）的出现证明了基于层析分离的蛋白质纯化潜力。这些基质早期用于血清源性免疫球蛋白产品的纯化，其很大程度上依赖于 IEX 步骤和分级分离方法。然而，基于葡聚糖的填料并不适合大规模工艺，因为它们容易变形，并且需要低流速，以避免高背压。1964 年发现琼脂糖作为填料基质解决了这个问题，因为与葡聚糖基质相比，琼脂糖基球具有优异的液流特性。这些发现催生了新的填料产品，例如 Pharmacia Fine Chemicals 于 1967 年推出的 Sepharose 基质，于 1975 年推出交联琼脂糖，最终于 1985 年推出 Sepharose Fast Flow，它可以适应工艺规模层析所需的更高流速。尽管填料化学取得了进步，但早期生物制药产品的纯化工艺仍然依赖于额外的单元操作和各种层析模式，例如尺寸排阻层析、反相高效液相层析以及盐沉淀。

两个分子之间特定的生物相互作用可以用作层析纯化方法的证明对于新兴的生物制药行业来说是一个重要的发现。第一个记录的亲和层析工艺使用填料纯化酶，酶的竞争性抑制剂共价连接到填料表面，证明了高选择性纯化的潜力。Protein A 是一种从金黄色葡萄球菌中分离出来的蛋白质，对免疫球蛋白具有已知的亲和性，对其进行表征的工作已经在进行中，并且Protein A 在 20 世纪 70 年代初首次被提出作为纯化抗体产品的配基。Pharmacia Fine Chemicals 于 1975 年推出了第一个商业化的 Protein A 填料 Protein A Sepharose，并于 1978 年证明了其从小鼠血清中纯化免疫球蛋白的能力，收率接近 100%。早期的 Protein A 填料价格昂贵，工艺条件受到填料基质的限制，但 Protein A 填料的基质刚性、基球粒径和上样载量的逐步改进促进了它们在商业工艺中的采用，包括 OKT3 的生产。

原文：A.C.Szkodny, K.H.Lee, Biopharmaceutical Manufacturing: Historical Perspectives and Future Directions. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering, 2022.

撰稿人 |  开朗的豌豆射手 生物工艺与技术

责任编辑 | 邵丽竹

审核人 | 何发