基于多肽化学的合成和纯化技术及未来的挑战
多肽是重要的生物活性物质，多肽合成技术的日趋成熟，推动了活性多肽在医药食品及农牧业等领域的应用。基于此，研究介绍了多肽化学合成和纯化技术，分析了多肽合成和纯化技术特点，探讨多肽合成及纯化技术的未来发展，以期进一步提升多肽产业的发展质量。
多肽是介于氨基酸和蛋白质间的物质，已发现存在于生物体内的多肽达数万种，多肽能起到蛋白质的活性基因作用。多肽中的神经肽是神经元间重要的化学信使，生物活性肽是由酶水解蛋白质产生具有生物功能的肽，酪蛋白生物活性肽具有生理功能。随着人们对多肽氨基酸功能的了解深入，多肽合成技术日益成熟，多肽药物开发逐渐受到重视，通过多肽合成可以为多肽生物合成反应机制提供重要信息。多肽的化学合成技术日趋成熟，近年来固相法合成多肽成为常规方法。加强多肽化学合成与纯化技术研究对多肽的应用具有重要意义。
肽是a氨基酸以肽键连接形成的化合物，人体很多活性物质以肽的形式存在，肽主要作用是调节各系统和细胞的生理功能[1]。肽可以调节人体生理功能发挥生理活性，对人的细胞活性与生命非常重要。多肽是重要的生物调节物，由氨基酸分子脱水缩合成化合物为二肽，多肽是三个以上氨基酸分子脱水缩合成的化合物。多肽类型分为生物活性与人工合成多肽，活性肽包括免疫神经活性肽与其他活性肽等，生物提取多肽具有很强的活性，人工合成多肽需要筛选才能被人体安全使用。目前人们只能合成相对较短的肽链，固相合成技术存在很大局限性，寻找绿色环保的多肽合成技术是未来发展面临的挑战。
活性多肽包括谷氨酰胺肽、生长刺激多肽等，活性多肽营养价值丰富，主要生物效应是刺激靶细胞增殖分化，活性多肽对胚胎发育具有重要作用[2]。研究发现活性多肽具有调节B细胞和真皮树突形成发育等功能，刺激结缔组织、合成纤维细胞等分泌细胞淋巴因子和胞外蛋白等，活性多肽通过调节不同细胞活动参与组织器官形成调节，对创伤后引发器官受损功能削弱具有重要的修复重建功能。目前活性多肽广泛应用于医药食品及化妆品等领域，活性多肽使蛋白质药物活性作用位点集中于较短的多肽链上。食用多肽主要作用是维持机体正常生理活动，食品显著特点是易吸收可作为营养添加剂。
多肽产物在制药工业中应用取得巨大发展，多肽合成方式分为化学与生物合成，化学合成含有特定顺序多肽时不需要反应基团保护合成目标产物的定向性[3]。多肽液相片段合成法在蛋白质合成领域取得重大突破，以多肽液相和固相和合成法为基础发展出组合化学法等。多肽生物合成法包括酶解法与发酵法，以DNA 重组技术为主导的基因工程法应用于多肽的合成。图1为多肽合成示意图，目前对活性多肽分离纯化采用反相高压液相色谱等方法取得良好效果。
生物活性多肽制备方法包括重组菌生产、化学合成法与酶解法等。化学合成广泛应用于生产高价值的短到中长药理级肽。提取法提倡使用奶酪原料，提取法成功的关键是发酵用菌的选择，菌种的改良是重要工作[4]。重组DNA 法生产多肽存在生产效率问题，由于许多生物活性肽氨基酸较少，可设计叠加方案将活性肽基因串联成重复序列设计酶切位点，简单媒介工艺可得到小分子多肽。酪啡肽制备酶解法关键是选择合适的酶确定水解条件，食物蛋白水解研究中涉及枯草杆菌蛋白酶等多种，酶的选择要求专一性强，对酪啡肽水解制备中动物消化蛋白酶最为常见。有学者研究通过微生物蛋白酶嗜热菌蛋白酶水解消化物得到阿片肽活性，在胃蛋白酶等处理后发现阿片肽活性。
生物活性肽分离纯化普遍采用Sephadex 柱析层等方法取得较好效果。RPLC 在20 世纪80年代后逐步应用于生物大分子的鉴定，RPLC 流动相以水为基本部分，流动相中的有机溶剂可能使肽的天然构象发生变化。研究用RPLC 对化学合成多肽进行分离纯化纯度达96.4%。图2为高效液相色谱HPLC 流程示意图，超滤是利用膜的选择性，通过溶液中组分透过膜的迁移速率不同实现非均相物系的分离[5]。HPCE 是溶质以电场为推动力实现高效快速分离的新型电泳技术，HPCE 具有高效快速等特点，目前广泛应用于无机离子、手性化合物等研究分析中。生物制品分离纯化技术成为产业化的关键，要根据分离多肽物质性质采用分离手段，应结合使用多种分离分析方法满足对样品纯度的要求。未来会建立完整的多肽类物质分离提纯技术，满足科研及生产的需要。
随着科技的进步，生产肽的方法不断发展。常用的生产方式包括酸解法、固相合成法等，多肽固相合成将目的肽氨基酸C 端通过共价键与固相载体连接，多肽固相合成法不断完善能够合成具有生物活性的多肽，但仍存在直接合成序列短、合成效率低等问题。多肽液相分段合成作用日益突出，多肽液相分段合成天然化学连接存在一些局限，施陶丁格连接法为多肽片段连接途径开拓广阔的思路。
多肽组合技术为快速合成生物活性肽类化合物提供全新的思路，组合化学技术需要相关科学的发展完善。多肽组合化学技术应用需要有先进的分离纯化手段配套，敏感有效快速的分析鉴定手段。活性多肽的研究为动物生理化学等学科提供广泛的研究领域，如何实现高效率分离纯化与检测鉴定等成为研究的热点。生物制品分离纯化技术对推动我国多肽类保健食品产业化具有重要意义，各种新的分析方法及联用技术推动其研究进展。我国活性多肽将在分离纯化方法深度研究、多肽结构化学锈蚀等领域开展更多攻关。目前国内对酪啡肽研究停留于结构层次，生物活性肽研究突破食物蛋白仅提供氨基酸的旧概念，如何进行低成本大批量生产等成为新的研究热点。
随着医疗卫生方面对多肽产品需求日益增加，多肽合成技术的出现有助于解决多肽类为主要成分的重要应用需求问题，应用多肽合成技术合成多肽满足中药资源需求。多肽产业高速发展需要更加方便有效易于实现规模化生产的合成及分离纯化技术。目前多肽产业发展面临研发诸多问题，应通过完善原有技术等途径保证多肽产业的发展。多肽组合化学技术应用需要设计合成策略，在多肽药物开发中应用组合化学技术作为寻找肽类药物先导化合物工具。
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[3] 王金艳，董黎颖，刘雅妮，等.蜈蚣毒素多肽RhTx的高效化学合成及复性折叠研究[J].有机化学，2021，41（7）：2800-2809.
[4] 郑龙，田佳鑫，张泽鹏，等.多肽药物制备工艺研究进展[J].化工学报，2021，72（7）：3538-3550.
[5] 谢博，傅红，杨方.生物活性肽的制备、分离纯化、鉴定以及构效关系研究进展[J].食品工业科技，2021，42（5）：383-391.
撰稿人 | 陈晓宇 盘锦检验检测中心
责任编辑 | 胡静
审核人 | 何发
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