简介

第一个关于 RNA 分子递送的实验可以追溯到 1978 年，当时使用脂质体用编码兔珠蛋白的 mRNA 在体外转染小鼠淋巴细胞。此后，可电离脂质和 RNA 负载技术的进步推动了美国食品和药物管理局 (FDA) 于 2018 年批准了第一个基于 siRNA 的脂质纳米颗粒 (LNP) 治疗药物 Onpattro (Patisiran)。到 2020 年初，当 COVID-19 大流行发生时，几种装载 mRNA 的 LNP 制剂进入临床试验。2020 年 12 月，FDA 为 Pfizer-BioNTech (BNT162b2) 和 Moderna (mRNA-1273) 的 COVID-19 疫苗颁发了紧急使用授权 (EUA)，这两种疫苗均使用负载有编码病毒刺突蛋白 mRNA 的 LNP 作为免疫原。目前，多种RNA产品的LNP制剂，包括寡核苷酸（例如siRNA、miRNA、反义寡核苷酸等）、碱基修饰的RNA、序列优化的 RNA 和源自甲病毒、黄病毒、麻疹病毒和弹状病毒的自复制 RNA 正处于不同阶段的临床开发当中，其应用范围覆盖从疫苗到肿瘤治疗。一种基于 LNP 配制的自复制 RNA (ARCT-154) 的 COVID-19 疫苗在越南取得了有希望的 3 期疗效数据。

虽然两种已批准的 COVID-19 mRNA 疫苗在结构上相似，但 BNT162b2 使用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 作为溶剂（含有 20% w/v 蔗糖），而 mRNA-1273 使用 tris-HCl 缓冲盐水（ TBS；含 8% w/v 蔗糖）。据报道，这两种配方在这些蔗糖缓冲液中都能可靠地维持疫苗的稳定性和功效，但储存温度和寿命的范围很广；mRNA-1273 在 -20 °C 下保存长达 6 个月，而 BNT162b2 在 -70 °C 下浓缩并保存长达 6 个月，最新数据表明在 -25 °C 至 -15 °C 下保存两周也稳定。正如许多作者根据最近的大流行所指出的那样，关于关键存储参数（例如冷冻保护剂、分散剂、温度等）对 LNP-RNA 疫苗的影响，公众知之甚少。在已发表的数量有限的研究中，发现几个常见参数会影响存储结果。基于糖的冷冻保护剂，如蔗糖、海藻糖和甘露醇，可提高 LNP 在冻融和冻干过程中的稳定性。在不同的水性溶剂（例如水、盐水）或与有机溶剂（例如乙醇）的混合物中组装 LNP 对提高 LNP-RNA 的稳定性显示出较小的影响。然而，最主要的变量似乎是储存温度，范围从液氮中的快速冷冻到 4°C 的冷藏，其中不同的配方似乎有不同的温度。我们之前报道了一种由 TT3（类脂质可电离分子）、DOPE、胆固醇和 DMG-PEG2k 组成的配方，该配方负载有编码荧光素酶的 mRNA，该配方成功地在液氮中快速冷冻，并在 5% w/v 蔗糖或海藻糖的条件下保存长达 3 个月。另一方面，由未鉴定的可电离脂质、DSPC、胆固醇和 DMG-PEG2k 组成的制剂，其负载有编码 SARS-CoV-2 小鼠适应株的受体结合域 (RBD) 的 mRNA，在室温下维持至少 7 天，在 4 °C 下可能更长。另一项工作提出了咪唑修饰的脂质，它们似乎通过添加醚键和允许 pi 堆积的胺头基团形成高度稳定的 RNA 负载结构；令人印象深刻的是，该 LNP 在 PBS 中能够在 4°C 下保持 RNA 完整性和功能长达 25 周、在 25°C 下保持 18 周、在 37°C 下保持 3 周，而无需冷冻保护剂。

LNP-RNA 疫苗保质期差异较大的确切原因仍不清楚。此外，许多 LNP-RNA 稳定性研究都集中在使用编码报告基因（例如荧光素酶、GFP）的 mRNA 进行功能测量，而不是直接评估疫苗免疫原性，并且缺乏将 LNP 的结构完整性与疫苗活性联系起来的分析。为了帮助填补这一知识空白，我们在这里研究了冷冻保护剂、缓冲液类型（磷酸盐和 tris 缓冲盐水）和储存温度对负载自复制 RNA 的 LNP (LNP-RNA) 疫苗结构和功能维持的影响。

详细试验操作和结果，请参考原文。

讨论

本研究的目的是揭示在常用的储存条件（通过冷冻保护剂浓缩、缓冲液类型和维持温度）下装载自复制 RNA 的脂质纳米颗粒 (LNP-RNA) 发生的物理变化，以及这些变化如何发生。差异与体内转染和疫苗效力有关。我们在本研究中采用的特定 LNP 配方包括两种可电离脂质（TT3 和 DLin-MC3-DMA），我们发现它们组合可在肌肉和体液免疫反应中提供有效的转染，并加入 5 mol% 的 DMG-PEG以补充近中性电荷 LNP 的稳定性。使用该配方，我们发现磷酸盐和 tris 缓冲液都适合储存 LNP，并且蔗糖是维持 repRNA 有效负载的结构完整性、物理稳定性或活性的重要冷冻保护剂。主要因素是储存温度。

最佳蔗糖浓度为 10% w/v，与其它已发表的生物材料冷冻保护研究结果类似。据认为，对于设定的材料浓度，需要最小数量的糖分子来充分破坏极性水分子之间的相互作用（通过形成水-蔗糖氢键）以减慢冷冻速度，并形成冰-水界面最小化的较大冰晶。事实上，据报道，蔗糖不是均匀地分散在整个样品中，而是沿着脂质双层表面形成非冻结状态的薄片，并防止材料与冰直接接触。根据经验，10% w/v 蔗糖使这些过程能够有效促进颗粒结构的保留而不发生聚集。

动态光散射 (DLS) 是一种常用于评估颗粒稳定性和流体动力学粒径分布的技术。然而，仅仅依赖 DLS 提供的散射数据可能会在准确性方面产生误导，特别是对于多分散的亚 100 nm 颗粒，其强度和数量分布都无法提供准确的信息。因此，我们还进行了透射电子显微镜（TEM）和低温电子显微镜（cryo-EM），以充分捕获 LNP 从储存解冻后的物理状态。有趣的是，在-20°C下储存能够保持LNP结构完整性，而在-80°C下解冻颗粒后观察到不可逆的聚集。但这似乎只适用于repRNA；当相同的 LNP 装载 mRNA 并储存时，颗粒在所有测试温度下都保持其结构完整性。其他研究也报道了在较低温度下稳定的 LNP-mRNA 制剂（例如，BNT162b2 COVID-19 疫苗在 70 °C 下储存）。我们假设携带repRNA与mRNA的LNP的行为之间的这些差异可能反映了RNA分子与纳米颗粒中的脂质在分子水平上的包装结构的潜在差异和/或与差异相关的颗粒稳定性的差异：用于 mRNA 与 repRNA 的N: P 比率，导致对冷冻/解冻过程的敏感性不同。基于甲病毒的自复制 RNA 比疫苗中使用的典型 mRNA 大约 10 倍，并且可能以与较短 mRNA 不同的方式与 LNP 核心组织在一起。此外，我们采用 2:1 N:P 比例在 LNP 中有效包装 repRNA，RNA 封装效率约为 90%，并且可有效体内递送，而文献报道相同的 N:P 比例可以将 mRNA 分子的封装效率降低至仅 40%。此外，-80°C 提供介于-20°C 慢速冷冻和-200°C 快速冷冻之间的中间值。虽然从室温冷却到-20°C预计会引起缓慢但短暂的冷却，从而产生分散在未冻结液体和蔗糖片（液体+冰相）中的大冰晶，但-200°C快速冷冻预计会立即形成固体几乎没有冰核的冰（固相）。相比之下，与-20°C相比，从室温冷冻到-80°C预计会具有更快的冷却速率，因为水能够在低于-40°C的情况下冻结而不成核。因此，所得状态将具有与玻璃相混合的较小冰晶的混合物，其中颗粒和蔗糖分子被浓缩。与大晶体相比，较小的冰晶具有更大的界面面积，这不利于冷冻保存。此外，玻璃相中颗粒的浓缩可能进一步促进不稳定颗粒的聚集。因此，我们假设载repRNA的LNP在冷冻至-80°C或从-80°C解冻期间更容易聚集，这是由于当载repRNA而不是mRNA时，颗粒的独特结构特性以及在此温度下形成的冰相类型和冷却速率。

我们发现 LNP 结构的维持（通过光散射和 TEM 形态分析确定）不一定是储存后体内功能的忠实指标。例如，与新鲜制备的样品相比，根据 DLS 和电子显微镜结果，LNP-RNA 在 4 °C 下的储存能够保留颗粒的物理状态，但未能发挥作为当使用报告基因repRNA或抗原编码repRNA进行活性研究时的功能。这一结果表明，虽然 4 °C 储存足以保持 LNP 递送载体完整，但封装的 repRNA 分子会受到负面影响。图 5f-j 中解冻后保质期测试的结果进一步支持了这一想法，其中有效储存并解冻 4°C 储存的疫苗显示出疫苗效力在 4°C 下超过一天后下降。一项计算 RNA 分子理论切割率的研究预测，4000 个核苷酸的 mRNA 分子在无 RNAse 条件下储存在 5 °C 时，半衰期为 941 天，但更长的 repRNA 会更容易发生水解断裂。虽然此类反应在冷冻温度下不成问题，但在冷藏中必须防止 RNA 降解，尽管 LNP 可能提供 RNA 分子的保护涂层；因此，我们在 4 °C 下保存的 LNP-RNA 样品中观察到的功效下降和变化可能是由于这种降解反应造成的。事实上，我们发现仅在 4°C 保存一周的 LNP 中存在大量 RNA 泄漏。我们注意到的另一个观察结果是，虽然 4°C 储存能够保留相对较高的转染率，但其产生体液反应的下游功效显著降低。RNA 序列可能对转染有影响，尤其是在长 repRNA 中，其中核苷酸序列的差异可能会影响其在 LNP 中的包装，进而影响其在冷冻和解冻过程中的稳定性。此外，补充图S7显示，与新鲜制备或储存在-20°C或-200°C的疫苗相比，储存在4°C的疫苗在肌肉中产生的细胞因子减少；因此，我们认为，尽管 LNP 保持了足够的转染细胞的能力，但从 4 °C 解冻的 LNP 可能会降低佐剂活性。我们假设 4°C 储存后 RNA 从颗粒中泄漏可能导致 LNP 的内部堆积结构发生变化，达到炎症程度较低的状态，和/或在注射部位递送到细胞中的 repRNA 减少可能导致先天免疫反应减弱。

与 4 °C 储存相反，闪冻至 -200 °C 的 LNP 在体内基因表达方面表现良好，尽管这种储存方案通过电子显微镜显示出严重的聚集。这种聚集可能是电子显微镜中样品制备步骤的结果，例如在 TEM 中在网格上干燥或在冷冻电镜中进行另一轮快速冷冻。快速冷冻的 LNP-RNA 对解冻后处理的脆弱性或敏感性可能表明我们在新鲜制备、4°C 储存或 − 20°C 储存的样品中未观察到未知的材料特性。再加上冷链运输的液氮维护不切实际，闪速冷冻似乎不是合适的存储选择。

总体而言，LNP-RNA 疫苗在含10% w/v 蔗糖的PBS 中在 -20°C 条件下在物理上和功能上均保持良好，储存至少30天。这个温度为疫苗的冷链运输提供了可行的解决方案，Moderna 的 COVID-19 疫苗 (mRNA-1273) 就证明了这一点。对于我们的 LNP-RNA 系统，-20 °C 可能是一个足够高的温度，可以提供理想的冰成核温度以及缓慢的冷却速率，以帮助保留颗粒结构，同时也是一个足够低的温度，可以抑制水解裂解事件引起的 RNA 降解。

更理想的解决方案是将 LNP-RNA 疫苗冻干成干粉形式，在室温下保存良好。然而，这一努力已被证明具有挑战性，文献中几乎没有成功冻干 LNP-repRNA 制剂的报道。我们的结果表明，虽然几个参数的优化能够改善制剂的结构维持，但与新鲜 LNP 完全等效的体内转染仍然难以实现，这与之前另一项携带 mRNA 的 LNP 研究的结果相呼应。冷冻干燥疫苗可能会使 RNA 分子在重悬期间更容易水解降解或在体内与血清蛋白相互作用。另一方面，Ball等人在冻干之前，将装载有 siRNA 的 LNP 在液氮中闪冻 30 分钟，发现在去离子水中复溶冻干 LNP 后，其体外基因沉默能力显著降低至 35%，而在复溶过程中添加 22% 乙醇成功地维持了其体外基因沉默能力。基因沉默水平与新鲜制备的 LNP 相似（80% vs 90%）。尽管复溶成功，但在乙醇中施用制剂或在施用前去除乙醇的附加过程将难以转化为临床环境。

尽管如此，LNP-RNA 制剂的成功冻干可能需要比学术实验室使用的基本台式冷冻干燥机更好地控制冷冻和干燥温度。在工业界，Moderna 报道称，他们目前处于 2 期临床试验的巨细胞病毒疫苗 (mRNA-1647) 可以成功冻干并在 5 °C 下保存超过 18 个月。此外，Arcturus Therapeutics 与新加坡杜克-新加坡国立大学医学院合作还报道了其封装 repRNA 的 LNP 疫苗 (ARCT-021) 的成功冻干。不幸的是，该过程的详细信息并未公开。最近，据报道，一种有效的 mRNA 疫苗冻干方法，使用优化的冷冻步骤和两个独立的升华和解吸干燥循环，可以将其以干粉形式稳定地储存在 4°C 下长达 24 周。

总结

鉴于COVID-19大流行，疫苗的长期储存和冷链运输已成为成功转化和使用装载RNA的脂质纳米颗粒（LNP-RNA）的关键步骤。与此同时，我们开始意识到，关于LNP-RNA的物理性质、储存条件和疫苗功效之间关系的信息非常缺乏。在这里，我们使用编码报告蛋白（例如荧光素酶）以及实际的HIV免疫原的 RNA，研究了疫苗在不同储存条件下（通过冷冻保护剂浓缩、缓冲液类型和储存温度）发生的物理变化，以及这些变化与疫苗体内功效的关系。最终，我们发现 LNP-RNA 疫苗可在含有10% w/v 蔗糖的PBS 中在 -20 °C 下稳定保存至少 30 天。此外，我们发现携带复制子的 LNP 也可以冻干并保留大量的体内生物活性。

撰稿人 | 生物工艺与技术

责任编辑 | 胡静

审核人 | 何发