中图分类号：R978.1+2 文献标识码：A 胡小玲等[1]在对某厂庆大霉素原料药(批号：0003224)的研究中发现该原料药中除含有GMC1、C2和C1a外，还多含有一个次要组份;经 TLC、HPLC测定初步认为该次要组份与西索米星(sisomicin，SISO)同质。为最后证实这一个结论，我们采用国产弱酸型阳离子交换树脂 HD-2对该批号原料药进行柱层析且分离得到了该次要组份，本文报道对该次要组份的分离精制和结构测定。

1 材料 　　分离柱：60cm×2.5cm(玻璃制);树脂HD-2弱酸型阳离子交换树脂(华东理工大学华昌聚合物有限公司);精制柱：55cm×1.5cm(玻璃制)羧甲基葡聚糖凝胶C-25(CM-sephadexC-25，AmerchamBiosciences公司出品);自动部分收集仪BS-100A(上海市沪西仪器厂);恒流泵HL-1(上海市沪西仪器厂);旋转薄膜浓缩仪1800-Ⅰ型(上海玻璃仪器二厂);硫酸庆大霉素标准品：中国药品生物制品检定所提供;硫酸庆大霉素原料药：批号0003224;硫酸西索米星对照品：无锡第二制药厂提供;硅胶G薄板(TLC)：10cm×20cm硅胶G板(展层系统：氨水-甲醇-氯仿=1∶1∶1下相);仪器：日本岛津LC-10AD(SPD-10A紫外检测仪C-R7A数据处理器和CTO-10A柱温箱);色谱柱：日本岛津Shim-packCLC-ODS，5Lm，6mm×150mm;色谱条件：依照中国药典2000年版二部附录VD测定[4]，以水-冰乙酸-甲醇(25∶5∶70)配制的0.02molL庚烷磺酸钠溶液为流动相，流速为1mLmin，检测波长为330nm;柱温为28℃;核磁共振仪型号：1NOVA-400;测定条件：D2O400mHz(上海医药工业研究院核磁共振室)。

2 次要组份分离和精制

2.1 分离 　　处理好的HD-2树脂湿法装柱，先用1molLNH4OH洗柱，再用去离子水洗至pH8左右备用。硫酸庆大霉素样品5g溶于30mL去离子水中，上样，上样完毕后先用1L水洗，然后用0.1~0.3molLNH4OH梯度洗脱，部分收集，TLC检测，将Rf值与SISO对照品相同的组份合并，薄膜浓缩至干。

2.2 精制 　　将分离得到次要组份先用10mL去离子水溶解，然后再用3molLH2SO4调pH至 6.0左右，用凝胶柱精制，上样后先用500ml水洗，然后再用0.05~0.2molLNH4OH梯度洗脱，分部收集，采用TLC法和HPLC法检测，合并单组份，加入20mL去离子水，经微孔滤膜过膜，冷冻干燥得到约192mg次要组份。

3 结果 　　3.1 TLC 　　该次要组份经薄层层析分析，其Rf值与SISO对照品相同;用茚三酮显影均呈黄褐色斑点(图略)。 　　3.2 HPLC 该次要组份经HPLC分析其保留时间为29.282min，与SISO对照品保留时间(29.252min)相同(图1)。

3.3 1H-NMRSISO的结构见图2。

次要组份的1H-NMR化学位移及其归属见表1。

1H-NMR结果表明：(1)本品在D1.145和2.729处各有一个甲基单峰，分别为4″-CH3和3″-N-CH3;(2)D4.948为一个被裂分为双峰的差向氢信号，D5.414也应为一个被裂分为双峰的差向氢信号(因J很小，图未示出裂分)，提示本品有两个糖苷键，它们的J均小于4Hz，表明为eq键(即糖苷键为A构型);(3)本品有四个亚甲基，其中2-CH2、3′-CH2、5″-CH2的两个质子化学位移不同，处在高磁场的为ax键，低磁场的为eq键。6′-CH2的两个质子化学位移基本相同，故不处在环中。

3.4 13C-NMR和DEPT谱次要组份的13C-NMR和DEPT测定数据和化学位移及其归属见表2。

13C-NMR和DEPT谱表明：(1)本品有19个碳原子，其中有2个甲基(CH3)碳，4个亚甲基(CH2)碳及2个季碳，其余为11个次甲基碳;(2)化学位移22.478处有一个C4″-CH3，36.132处有一个C3″-NCH3;(3)DEPT图显示本品在化学位移25.091、 28.905、42.121和69.156处有四个亚甲基碳，应分别属于C3′、C2、C6′和C5″;(4)13C-NMR谱和DEPT谱相对照，71.423和145.081碳信号在DEPT中消失，说明各为季碳，归属于C4″和C5′。 　　3.5

结论 　　从TLC、HPLC、13C-NMR、DEPT等分析结果表明该次要组份与SISO同质。

4 讨论

(1)郑绳一等[3]首先采用国产羧甲基葡聚糖凝胶C-25和硅胶柱层析，对我国某厂生产的庆大霉素原料药(批号78107)进行组份分离，分离得到 GMC1、C2、C1a单组份，并经1H-NMR测定与国外报道的同质;龚炳永等[4]采用阴离子交换剂SA-10A(OH-)层析柱对国产庆大霉素组份进行了分离和研究，并用1H-NMR将各主组份分别鉴定为GMC1、C2、C1a，此外还分离得到一个假二糖的次要组份;缪昌城等[5]采用国产硅胶G对国产庆大霉素C族组份进行了分离，并用羧甲基葡聚糖凝胶C-25精制经1H-NMR测定其GMC1、C2、C1a纯度均可达99%以上。我们采用国产 HD-2树脂进行庆大霉素次要组份的分离并获成功，这在国内尚属首次报道。 　　(2)SISO是在1970年发现的氨基糖苷类抗生素[6]，由于当时测定条件限制，可能仅采用了1H-NMR来确定SISO的结构，但未见其报道;由于近代科学技术的发展，我们采用1H-NMR、13C-NMR和 DEPT等方法详细确定了SISO的结构，比过去的方法更精确。在表2中列出的文献报道值，两者相比较测定的碳原子化学位移基本相同。但本品的1H- 1HCOSY谱和13C-1HCOSY谱(图谱略)明确显示D98.649为C1′信号，101.844为C4′的信号而不是如文献列出的归属。

致谢：上海医药工业研究院核进行核磁共振图谱的测定，吴林森研究员指导结构解析，钱国芬参加部份工作，特此致谢!

参考文献 [1]胡小玲，赵敏.庆大霉素次要组份的早期鉴别和发酵初控[J].中国抗生素杂志，2004，29(7)： [2]程振泰，高悟岩，陈久信.小单孢菌产生氨基糖苷类抗生素T125-Ⅰ的研究Ⅲ. 抗生素T125-Ⅰ的鉴别[J].抗生素1985，10(1)：10[3]郑绳一，叶霁青.庆大霉素主要组份的分离和结构研究[J].抗生素，1980，5(1)：5[4]龚炳永，周亦昌，冯培德.国产庆大霉素组份的研究[J].抗生素，1980，5(5)：1[5]缪昌城，林玲，洪丽娜，等.国产庆大霉素C族组份的制备[J].抗生素，1981，6(5)：1[6]WagmanGH，TestaRT，MargueyJA.Antibiotic6640Ⅱ Fermentation，Isolation，andproperties[J].JAntibiot，1970，23(2)：555