除菌过滤的重要方面包括过滤器的鉴定、过滤工艺的验证以及过滤器完整性测试的执行。除菌过滤器在使用前必须进行灭菌。灌装一批产品后，最迟一个工作日后，应丢弃除菌过滤器。对于小批量产品，出于成本原因，可以考虑将其重新用作预过滤器，但需要进行适当的验证。

工艺过程中必须使用合适的预过滤器和除菌过滤器来控制和维持较低的产品生物负荷。这有助于确保最终除菌过滤的成功。标称孔径为 0.2 µm 至 0.22 µm 的过滤器用作除菌过滤器。过滤器必须与产品兼容并符合上市许可中的描述（欧盟 GMP 指南附件 1，第 8.79 段）。

过滤系统（过滤器和连接）的设计应满足以下要求（欧盟 GMP 指南附件 1，第 8.82 段）：

• 允许在已验证的工艺参数（如温度、粘度、压力等）下操作

• 保持滤液的无菌性

• 尽量减少除菌过滤器和产品最终灌装之间的无菌连接数量

• 允许按要求进行清洁程序

• 允许按要求进行灭菌，包括在线灭菌 (SIP)

• 允许对除菌过滤器进行现场完整性测试，最好作为封闭系统

除菌过滤器的鉴定/验证

除菌过滤器通常以其孔径为特征。如前所述，孔径应为 0.2 µm 至 0.22 µm。指定的孔径是“标称的”，即该规格基于制造商在理想条件下计算的值。这意味着过滤材料中也可能存在更大的孔径。

对于表征来说，更重要的是截留能力，它受过滤过程的所有因素影响。通常认为过滤效果类似于筛分功能。虽然对于几何固体颗粒，颗粒大小对于分离效果具有决定性作用，但在微生物过滤中也会出现其它影响。微生物和小颗粒通过吸附被保留在孔内，这取决于以下因素：

• 压差

• 流速

• 颗粒计数

• 表面张力

• 电离度（吸附带负电荷的微生物和细菌内毒素）

这里非常重要的一点是压差，它不能导致微生物变形。如果微生物变形，它就会透过，也就是被挤压通过过滤器。

对于除菌过滤，必须考虑以下因素：

• 颗粒（包括微生物）的数量越多，未被截留的颗粒数量就越多。这意味着生物负荷水平对过滤的有效性有很大影响。这清楚地表明，生物负荷应尽可能低。确定监测程序中发现的细菌类型对于了解细菌的大小非常重要。

• 压差越低，微生物分离的可能性越大。

• 生物在孔隙中停留的时间越长，其截留就越稳定。

对于过滤器的鉴定和验证，必须考虑各种方面。相关信息可在欧盟 GMP 指南附件 1（第 8.80 和 8.81 段）和欧洲药品管理局“关于药品、活性物质、赋形剂和主容器灭菌的指南”中找到。最重要的方面如图 1 所示，并进行了简要说明。

过滤器验证的各个方面：

• 适合使用：确保过滤器满足工艺和生产条件的所有要求（例如关于温度、压力等）。

• 灭菌：确保过滤器的灭菌方法有效且不会损坏过滤器。

• 稳定性：确保过滤器不会对产品产生负面影响。

• 兼容性：确保过滤器不会受到产品的负面影响或吸附活性物质。

• 溶出物/析出物：识别、量化并评估可能从过滤器迁移到药品中的成分的影响。

• 截留能力：确保过滤器可以去除药品中的微生物。

• 完整性检测：确保过滤器的截留能力可以通过非破坏性测试（例如，泡点，压力保持测试等）进行验证。

除菌过滤验证（细菌截留）

除菌过滤验证（细菌截留测试，欧盟GMP 指南附件 1，第 8.84 段）必须根据相关药典方法（附件 1，第 8.83 段）进行。必须考虑溶液中药品浓度和溶液基质效应的最坏情况。用于验证的攻击生物应该有充分的依据。ASTM F8383-005 规定使用攻击生物 Brevundimonas diminuta （缺陷短波单胞菌）来验证截留能力。使用这种微生物是因为其体积小并且存在于水系统中。然而，有必要检查现场发现的现有微生物的大小是否代表最坏情况。在这种情况下，应使用相应的内部微生物。

了解生物负荷（即待过滤溶液的微生物负荷）非常重要，原因如下：

• 过滤器可能有一些孔径大于标称孔径，因此一定大小的微生物可能能够通过。因此，了解微生物的类型很重要。

• 可以假设，当过滤介质中的细菌数量增加时，细菌通过过滤器的概率也会增加，因为过滤器的负荷会增加。因此，了解细菌负荷的程度很重要。

为了进行验证，产品中应存在每 cm²过滤器表面107 CFU 的测试细菌浓度（最坏情况）。在这种情况下，过滤应提供无菌产品。生物负荷也是 IPC 监控点，必须在常规生产过程中确定。为此，在除菌过滤器之前采集溶液样本。

在实际测试之前，必须检查待测试产品是否可用于验证。所谓的活性测试提供了有关产品是否具有除菌效果的信息。为此，在整个过滤过程中，在产品溶液中培养一定数量的测试细菌。测试细菌数量的减少表明产品具有除菌效果。在这种情况下，可以在过滤验证期间使用替代品（欧盟 GMP 指南附件 1，第 8.84 段）。

欧盟GMP指南附件1在第8.85段下列出了验证期间应涵盖的的参数（见图1）。

欧盟 GMP 指南附件 1：无菌药品生产 对无法在最终容器中进行终末灭菌的产品进行除菌过滤   8.85验证期间应考虑和确定的过滤参数包括但不限于： i. 用于过滤器完整性测试的润湿液： 应根据过滤器制造商的建议或所要过滤的流体，制定适当的完整性测试值规范。 如果使用产品以外的流体冲洗系统或进行完整性现场测试，则应采取适当的措施，避免对产品质量造成任何有害影响。 ii.过滤工艺条件包括： 流体预过滤保持时间及其对生物负荷的影响 过滤器润湿，必要时使用液体 最大过滤时间/过滤器与液体接触的总时间 最大工作压力 流速 最大过滤体积 过滤已知体积的溶液所需的时间以及过滤器两端所需的压力差

图 1：欧盟 GMP 指南附件 1：除菌过滤验证

在制定验证计划时，重要的是要考虑生产过程中所有参数的极值对过滤器性能的影响。应进行风险分析以确定最坏情况的参数和变量。风险分析有助于根据对产品、流程和各个系统组件的影响对验证要求进行分类。同时，它有助于减少总体验证工作量。

通过风险分析，可以将相似的产品归类为产品系列，并仅对一种产品进行验证。但是，这只有在涉及相同活性物质的情况下才有可能。类似配方中的不同活性物质不能归类在一起。

过滤器灭菌

用于除菌过滤的每个除菌过滤器或系统在使用前都必须进行灭菌。灭菌既可以在线进行（即安装时），也可以在高压灭菌器中离线进行。

灭菌时必须遵守制造商的说明。灭菌通常在 121 摄氏度下进行，持续时间为 20 至 30 分钟是合适的。一些过滤器装置也可以在 134 摄氏度或 145 摄氏度下灭菌 30 分钟。

灭菌过程中，蒸汽必须完全流过过滤器。如果不能完全实现这一点，则可能会产生气穴。饱和蒸汽无法在这些区域发挥作用。在这些点处会产生过热蒸汽，无法达到最大的灭菌效果。

可能的解决方案包括：

• 经过验证的初始真空循环对于高压灭菌器中的灭菌至关重要。

• 对于 SIP，必须以适当的方式布置阀门，以确保安全地通过排气去除气穴。

• 强烈建议在验证运行期间加入生物指标。

过滤器的现场灭菌过程的有效性通常受滤芯中冷凝物形成的影响。形成的冷凝物会堵塞孔隙，并可能阻止蒸汽流过湿润表面。在这种情况下，过滤器加热不均匀。解决此问题的方法是缓慢加热并检查出口处维持的蒸汽压力。

过滤器完整性检测

使用前和使用后必须检查过滤器的完整性（即完好性）。此项要求可在欧盟 GMP 指南附件 1 （见图 2）和欧洲药典（5.1.1 无菌产品的制备方法）中找到。

欧盟 GMP 指南附件 1：无菌药品生产 对无法在最终容器中灭菌的产品进行过滤除菌   8.87应通过在使用前进行完整性测试（使用前灭菌后完整性测试或 PUPSIT）来验证除菌过滤器组件的完整性，以检查在使用前过滤器准备过程中是否造成损坏和完整性丧失。用于对液体进行除菌的除菌级过滤器应在使用后进行非破坏性完整性测试，然后才能从其外壳中取出。完整性测试过程应经过验证，测试结果应与验证期间确定的过滤器的微生物截留能力相关。使用的测试示例包括泡点测试、扩散流、水侵入或压力保持测试。人们认识到，由于工艺限制（例如过滤极少量溶液），灭菌后可能并不总是能够进行 PUPSIT。在这些情况下，可以采取替代方法，前提是已经进行了全面的风险评估，并且通过实施适当的控制措施来降低非完整过滤系统的风险，从而实现合规性。

图 2：欧盟 GMP 指南附件 1：过滤器完整性测试

必须特别注意附件 1 中的要求，即在使用除菌过滤器之前对其进行过滤测试。在开发过滤工艺时，必须将这项称为 PUPSIT 的测试纳入工艺设计中。这项要求在实践中并不容易实施，因为进行测试不得危及过滤器和过滤系统的无菌性。

PUPSIT 可能存在例外，但必须有适当的理由并通过相应的风险分析进行记录。

如果除菌过滤步骤由多个过滤器组成，并且已经对液体的无菌性进行了验证，则该系统被视为单个除菌单元，并且系统内的所有过滤器在使用后都应顺利通过完整性测试（欧盟 GMP 指南附件 1，第 8.91 段）。

过滤器完整性测试应在过滤器安装后进行。使用目前市场上的测试设备可以轻松完成此操作。

FDA 也要求进行完整性测试，并强调在过滤器使用后进行完整性测试。对于 FDA 来说，使用前的完整性测试仍然是可选的。（FDA 行业指南，无菌工艺生产的无菌药品 - 现行良好生产规范，2004 年，第IX 章无菌生产和灭菌验证，B 部分过滤有效性。）

正如欧盟GMP指南附件1中提到的，建议采用几种测试方法来检查膜过滤器的状况和性能：

• 泡点试验

• 压力衰减试验

• 扩散流试验，或前进流试验（气体扩散）。

图3. 描述了这些测试程序的实施和特殊方面。

检测	执行/特殊考量
泡点测试	气泡点对应于推动空气通过过滤器充满液体的孔所需的压力。这种压力可以通过清楚的气泡流来识别，因此得名。这个压力取决于过滤器的表面张力以及过滤器的孔径和润湿角度。因此，测试也取决于过滤材料和孔径。对于0.2 μm过滤器，该值约为3.4至4.8 bar（醋酸纤维素和硝酸纤维素）。知道泡点压力对于进行气体扩散试验是很重要的。
压力保持测试	在保压测试期间，压力被施加到过滤器的非无菌侧(大约泡点压力的60%)。压力必须保持3-5分钟（在一定的公差范围内）。如果出现压降，则说明过滤系统损坏（密封件损坏、过滤器机械损坏等）。该测试总是对整个过滤系统进行，即过滤器外壳和进、出口。因此，该测试也非常适合于过程中控制（PUPSIT）。
扩散流/前进流测试	气体扩散速率是在前进流试验中确定的。要做到这一点，过滤器要承受80%的泡点压力。测量空气通过气孔扩散的速度。

图 3：过滤器完整性测试

所有这些测试都高度依赖于润湿液体的表面张力。因此，当使用具有不同表面张力的液体（例如水、酒精、消毒剂或类似物）润湿时，会获得不同的值。因此，应事先决定是否应进行产品特定的完整性测试或使用标准介质（例如水）的完整性测试。在针对产品的完整性测试的情况下，过滤器制造商通常是直接联系点，他们可以开发针对产品的泡点测试。

过滤器完整性丧失

如果过滤器没有通过测试，可能有以下几个原因：

• 压力波动（灭菌或过滤过程中）

• 灭菌条件不适宜（例如滤芯内部凝结或压差过大）

• 机械损坏（例如在组装过程中）

过滤器未通过完整性测试的原因不一定是过滤器损坏。测试失败的其它原因也可能是：

• 过滤器冲洗不当

• 过滤器未完全润湿

• 外壳缺陷

为了在过滤器被归类为有缺陷之前排除此类错误，PDA 在其技术报告第 26 号中建立了完整性测试故障排除指南（见图 4）。这为排除上述可能的故障提供了有用的说明。过滤器制造商通常会在其说明手册中提供自己的故障排除指南。这些指南根据特定过滤器的特性进行调整。

图 4：完整性决策树，来源：PDA 技术报告第 26 号

如果过滤后过滤器完整性测试失败，则生产批次的无菌性将受到质疑。因此，只能销毁该批次。即使产品无菌测试通过，这也适用。无菌测试只是一个“快照”，没有统计意义。

如果使用冗余除菌过滤系统（两个除菌过滤器并排），则可以测试冗余（即第一个）过滤器。如果该冗余过滤器通过了过滤器测试，则可以结合风险评估和根本原因分析放行该批次。但是，重要的是只使用一个过滤器进行验证（欧盟 GMP 指南附件 1，第 8.92 段）。

过滤器的重复使用

欧盟GMP指南附件1对最终除菌所用过滤器的重复使用有非常明确的规定：使用应限制为一批，最多一个工作日（见图5）。

欧盟 GMP 指南，附件 1：无菌药品的生产 对无法在最终容器中灭菌的产品进行过滤灭菌   8.94液体除菌级过滤器应在处理一批液体后丢弃，同一过滤器不应连续使用超过一个工作日，除非此类使用已经过验证。

图 5：欧盟 GMP 指南附件 1：过滤器的重复使用

但是，如果经过验证，可以将经过测试的除菌过滤器重新用作同一产品的预过滤器，以减少细菌负荷（减少生物负荷）。此验证还必须涵盖过滤器的清洁。清洁过滤器非常耗时，需要大量人力。还存在热原积累的风险，因为重新灭菌后残留的细菌内毒素不会被灭活。但另一方面，重复使用除菌过滤器可以节省成本，尤其是在生产小批量产品时。