在本研究中，研究了不同实验室规模圆柱形搅拌罐生物反应器和 Thermo Scientific HyPerforma DynaDrive一次性生物反应器之间补料分批和灌流实验的转移。使用不同的缩放参数，根据各自工艺的要求选择这些参数。在15至16天的补料分批实验中，达到了高达49×10 ^6 cells/mL的峰值细胞密度和高达5.2 g/L的抗体滴度。在50天的灌流培养中，维持了>100mm3/mL的活细胞体积，并收获了超过1 g/L/d的抗体。灌流工艺通过细胞废弃控制和葡萄糖浓度控制实现自动化。使用Repligen的XCell ® ATF 灌流系统和一次性设备进行细胞截留。总之，证明了在几何形状不同的实验室和中试规模生物反应器之间成功放大高产补料分批和灌流工艺的方法。与补料分批工艺相比，灌流的优点也被再次证实。

生物制药市场持续增长，在制药行业总销售额中所占的份额越来越大。单克隆抗体 (mAb) 主要使用中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞产生，发挥着最重要的作用。为了满足日益增长的需求，同时降低生产成本，众多公司和研究团体一直在尝试强化生产工艺。这种工艺强化集中于上游和下游工艺。在上游工艺强化的情况下，目标通常是从经典的补料分批模式切换到连续灌流模式，因为灌流工艺可提供更高的单位体积生产率。例如，使用 CHO K1 细胞的现代生产工艺可以在灌流模式下进行，单位培养体积每天 (vvd) 1–1.5 体积培养基的低灌流速率，活细胞体积 (VCV) 超过 100 mm3/mL，根据细胞直径，对应于约 100 × 10^6 cells/mL的活细胞密度(VCD) ，相比之下，通常在补料分批工艺中实现VCD 为 20 × 10^6 cells/mL至超过 30 × 10^6 cells/mL。根据生物反应器的体积，这种灌流工艺可以产生超过 1 g/L/d的 mAb。根据所使用的细胞系和过程控制，生产率最多可提高 8 倍。除了提高生产率之外，还可以实现更高且更一致的产品质量，并降低总体生产成本。

然而，对于具有如此高生物质浓度的生产过程来说，一个主要挑战是氧气转移。对于基于哺乳动物细胞的生产过程来说，高单位体积传质系数（kLa值）通常不是必需的，因为在这些补料分批工艺中只能实现低 VCD。因此，细胞培养生物反应器的设计方式是轴向搅拌器确保低搅拌器速度和低单位功率输入下的良好混合，因为长期以来在哺乳动物细胞培养中避免高剪切力是一个主要问题。然而，各种研究表明，使用传统用于微生物发酵罐的径向搅拌器，可以在高达 4700 W/m3的高单位功率输入下成功培养 CHO 细胞，这表明细胞对剪切力的耐受范围相当高。

对于上述灌流工艺可能需要这种更高的功率输入。由于现代生产细胞系、细胞培养基和灌流设备的可用性，高细胞密度工艺现在很常见。因此，必须重新考虑对细胞培养生物反应器的要求。一次性生物反应器现在在许多现代生物制药生产过程中占据主导地位，细胞截留通常使用 Repligen的交替式切向流过滤 (ATF) 系统进行。主要使用一次性系统是因为污染风险较低，无需复杂的清洁和灭菌程序，并且易于操作和使用后处置。Thermo Scientific针对高细胞密度灌流工艺进行了专门的设计，于2020年推出了HyPerforma DynaDrive 生物反应器平台，突破了传统的设计方法。PALL（现为Cytiva）使用 Allegro STR 平台已经表明，搅拌罐生物反应器并不总是需要是圆柱形的。HyPerforma DynaDrive 生物反应器具有矩形的占地，但与 H/D 为 1.0 的 Cytiva Allegro STR 相比，生物反应器高度 (H) 与生物反应器直径 (D) 的比率显著更高，为 2.9。此前，市售圆柱形搅拌罐一次性生物反应器的 H/D 比率范围仅限于 1.5 至 2.2 之间。较高的H/D比以及钻孔分布器产生的小气泡具有较大的比表面积，导致气泡的停留时间较长，从而导致k L a 增加。混合和功率输入是通过梯状装置实现的，该装置由一个靠近底部的搅拌器和三个不同高度的搅拌器组成。HyPerforma DynaDrive 生物反应器具有从中试 (50 L) 到工业 (5000 L) 的各种规模。实验室规模上没有几何可比的系统；这就是为什么抗体生产工艺的工艺开发通常在圆柱形搅拌罐生物反应器中进行。最常用的一次性系统之一是 Sartorius 的 Ambr ® 250，其优点是可以同时进行多个实验且自动化程度高。然而，仍需要定义将工艺从传统的圆柱形实验室搅拌罐生物反应器转移到中试规模的立方体 HyPerforma DynaDrive 的缩放标准。

各种生化工程参数，例如单位功率输入、kLa 值、混合时间和叶轮尖端速度，用于将基于哺乳动物的生产工艺从实验室规模转移到生产规模。保持这些参数之一恒定不可避免地会导致其它参数发生不同程度的变化。当放大传统的基于哺乳动物的生产工艺时，生物反应器的几何形状通常保持不变，并且恒定的单位功率输入最常用作扩大标准。这是有道理的，因为相同的几何形状和一致的功率输入提供相同的流动特性和功率输入分布，导致最小涡流没有变化，无论生物反应器体积如何。这些因素在化学工程过程中通常至关重要。然而，在一个系统中，该工艺的成功不是由反应物的完全相同的化学组成和分布决定的，而是由表达目的产物的活细胞决定的，所有物理和化学参数都可以在一定程度上变化。例如，Maschke等人定义了在轨道振荡系统中培养 CHO 细胞系的设计空间，考虑了特定的功率输入或涡流大小、混合时间和必要的氧气供应。由于在典型培养条件下，特别是在实验室规模下，流动不是完全湍流，因此细胞培养过程中通常会发生变化。所以，即使单位功率输入保持恒定比例标准，能量耗散分布也会随比例变化。因此，由于需要解决波动的流动条件，只要所有关键参数都保持在不会对细胞系产生负面影响的范围内，几何相似性的重要性在细胞培养过程中就变得可以忽略不计。

在本研究中，在实验室规模下，抗体生产过程在 250 mL 摇瓶（Corning ®，补料分批）、Ambr 250 模块化容器（Sartorius；补料分批）和 3 L HyPerforma Glass 容器（Thermo Scientific；补料分批和灌流）中进行。补料分批和灌流这两个工艺均在 50 L HyPerforma DynaDrive (Thermo Scientific) 中进行。在圆柱形实验室规模搅拌罐生物反应器和具有矩形结构的 HyPerforma DynaDrive 中进行测试之前，需要考虑合适的缩放标准。结果表明，当扩大或缩小基于 CHO 细胞的 mAb 生产工艺时，只要培养条件保持在合理范围内，生物反应器设计不会影响性能。因此，各种参数，例如 kLa 值和叶轮尖端速度，可以保持恒定并用作缩放标准，而不会对生长和产物形成产生任何可识别的影响。

详细的实验操作和结果，请参考原文。

表1. 三种不同搅拌罐生物反应器中补料分批培养的培养参数

图 1. 调节 2 L 和 50 L 灌流培养所需元件的简化示意图。WICR = 重量指示控制记录；XICR = 浓度指示对照记录；测量和控制点 XICR 1 = 葡萄糖浓度的测量和调节，XICR 2 = VCV 的测量和调节。

表 2. 灌流培养的培养参数。

图 2.采用间歇补料进行的补料分批实验期间 ( a ) VCD 和活力以及 ( b ) IgG 浓度的变化趋势（SF = 摇瓶，AM = Ambr 250，HPG = HyPerforma Glass 生物反应器，Viab = 活力）。SF 实验n = 3， AM 和 HPG 实验n = 1；误差线代表标准偏差。

图 3.采用连续补料进行补料分批实验期间 ( a ) VCD 和活力以及 ( b ) IgG 浓度的变化趋势（AM = Ambr 250，DD = HyPerforma DynaDrive 生物反应器，conti = 连续补料，Viab =活力）。n = 1 为 DD 实验，n = 2 为 AM 实验；误差线代表数据范围。

图 4. ( a ) N-糖基化谱（未显示总聚糖含量低于 1% 的聚糖）和 ( b ) 补料分批工艺第 14 天所产生的 mAb 的电荷异构体谱：SF = 摇瓶，AM = Ambr 250，HPG = HyPerforma 玻璃生物反应器，DD = HyPerforma DynaDrive 生物反应器）。SF 和 AM 实验n = 3， HPG 和 DD 实验n = 1；误差线代表标准偏差。

图 5.连续补料进行的三个灌流实验期间 ( a ) VCV 和活力、( b ) 单位活细胞体积灌流率 (CVSPR) 和 ( c ) 废弃率的变化趋势（HPG = HyPerforma Glass生物反应器，DD = HyPerforma DynaDrive 生物反应器，Viab = 活力）。

图 6.三个灌流实验期间( a ) 收获物中 IgG 浓度（IgGHarvest）、( b ) 通过 ATF 截留 IgG、( c ) 单位VCV IgG 生产率和 ( d ) 单位体积生产率的变化趋势（HPG = HyPerforma Glass 生物反应器，DD = HyPerforma DynaDrive 生物反应器）。

图 7. ( a ) 2 L 生物反应器中的灌流运行和 ( b ) DynaDrive 中的灌流运行期间的N-糖基化谱（未显示小于总聚糖含量 1% 的聚糖）。( c ) 在 2 L 生物反应器中进行灌流，以及 ( d ) 在 DynaDrive 中进行灌流期间的电荷异构体曲线。（HPG = HyPerforma Glass 生物反应器，DD = HyPerforma DynaDrive 生物反应器）。HPG实验n =1， DD实验n =2；误差线代表数据范围。

在这项研究中，研究了从圆柱形实验室搅拌生物反应器（例如 Ambr 250 和 HyPerforma Glass 3 L 生物反应器）到矩形搅拌 50 L HyPerforma DynaDrive 的工艺转移选项，后者在设计、搅拌器配置和通气方面完全不同。目标是在补料分批模式下实现高达 50 × 10^6 cells/mL的 VCD，在灌流模式下实现大于 100 × 10^6 cells/mL的 VCD。基于以下假设：即使对于非常高的 VCD，50 L HyPerforma DynaDrive 中的细胞在 40 W m -3的单位功率输入下也能得到足够的氧气供应，并且该功率输入也可以轻松转移到达到立方米规模的HyPerforma DynaDrive 生物反应器，该单位功率输入被定义为中试规模实验的培养标准。由于这种特定的功率输入无法在实验室规模的生物反应器中提供足够的氧气输入，因此必须考虑从 HyPerforma DynaDrive 到实验室规模的其它转移标准。假设 CHO 细胞能够承受相对较高的剪切力，但相同的 kLa 值将导致 Ambr 250 中的搅拌器速度非常高，叶轮尖端速度与 HyPerforma DynaDrive 中的叶轮尖端速度相同（40 W m−3）在 Ambr 250 中用作补料分批实验的共识缩放标准。在 2 L 灌流运行中，目标是实现更高的 VCD，使用与HyPerforma DynaDrive 中 40 W m-3相当的 kLa 值。

所选择的转移标准被证明适用于补料分批和灌流实验。在15至16天的补料分批实验中，获得了43至49×10 ^6 cells/mL之间的最大VCD。无论生物反应器规模如何，在搅拌的生物反应器中培养产生了4.5至5.2 g/L IgG的可比最终滴度。然而，在假设氧限制的摇瓶中，仅达到31±2×10^6 cells/mL和4.1±0.1 g/L。不同生物反应器中 mAb 的质量属性略有不同，但 Ambr 250 和 HyPerforma DynaDrive 在糖基化、电荷异构体和单体比例方面具有可比性。在具有较低 VCD 和 IgG 滴度的摇瓶中补料分批培养的结果表明，受控培养条件可以对细胞系的性能产生显著影响。然而，在充纯氧的受控生物反应器中，基于 1.4 至 2.5 mol/cell/h的摄氧率 (OUR) ，kLa 值仅需 8-14 h-1即可达到 50 × 10^6 cells/mL，Seidel 等人分析的 CHO 细胞的 OUR 数据的中间 50% 的范围。相比之下，在用空气-CO 2混合物充气的摇瓶中，60 至超过100 h-1的高kLa 值是必要的。然而，如此高的 kLa 值只有在非常高的振动速率下才能实现。由此得出的结论是，对于现代生产细胞系的工艺开发，细胞密度远高于 10^7 cells/mL是常见的，对于细胞系筛选的最后步骤，建议尽可能使用生物反应器系统最高水平的过程控制。

在灌流模式下，每次培养使用一个 ATF 组件，成功使用 50 天。使用 XCell ATF 2 的 2 L 工作体积培养与使用 XCell ATF 6s 的 50 L 工作体积的两次培养之间具有良好的可比性。尽管 IgG 截留量稳步增加，但在第 10 天到第 50 天之间有可能收获平均超过 1.0 g/L/d的抗体。进一步使用废弃液中的 IgG，即所谓的废弃回收，可以将单位体积生产率提高到超过1.3 g/L/d。使用生物反应器重量进行收获控制，使用介电常数探针进行废弃控制，使用葡萄糖探针进行葡萄糖控制，从而实现了自动化过程控制，在线样品分析仅用于确认在线值并监测其它参数，例如代谢物以及 IgG 的数量和质量。

在灌流运行的第 20 天和第 50 天之间，聚糖谱保持稳定，并且与补料分批结果相当。对于所有工艺来说，糖基化模式都是有希望的结果。观察到的主要聚糖是G0F和G1F，它们也是体内可以发现的主要聚糖。在灌流运行的大多数采样点，不带电荷的 mAb 异构体的存在比例高于补料分批实验。然而，单体含量略低于补料分批实验，但仍高于 94%。

表 3概述了 50 L 规模下不同工艺的单位体积生产率。补料分批模式下的 HyPerforma DynaDrive 提供了 0.33 g/L/d IgG的时空产量，而两个灌流工艺产生了 0.91 和 0.97 g/L/d。在第10天和第50天之间的生产阶段，单位体积生产率为1.05和1.12 g/L/d。因此，灌流工艺可以产生 2.8 至 3.0 倍的 IgG 滴度。Bausch等人报道，时空产量也类似地增加了 3 倍。然而，也有文献报道了更高的增加，但这些研究使用的细胞系在补料分批模式下产生的抗体滴度比本研究中使用的细胞系低 3 倍。

表 3. 补料分批和灌流模式的生产率以及可能的治疗次数的比较。* 在第 10 天和第 50 天之间的生产阶段。** 假设每个女性（60 公斤）每年使用 6.36 克单克隆抗体，下游工艺中单克隆抗体回收率为 80%。

因此，通过从补料分批切换到灌流模式来强化该工艺可以将 50 L 生物反应器的生产率大约提高三倍。本研究中使用的抗体曲妥珠单抗的市场数据证明了降低生物制药制造商抗体生产相关成本的重要性。原研产品赫赛汀2021年销售额达29亿美元，截至2022年6月已有六种生物仿制药上市。曲妥珠单抗用于治疗HER2阳性乳腺癌，早期乳腺癌患者（体重60 kg）辅助治疗需要6.36 g抗体。假设下游工艺的收率至少为 80%，每年可以使用 50 L 灌流生物反应器收获的产品治疗 2,000 多名患者。

结论

这项工作成功证明了基于 CHO 细胞的 mAb 生产补料分批和灌流工艺可从几何形状不同的搅拌罐生物反应器转移。当将补料分批工艺从 Ambr 250 扩展到 HyPerforma DynaDrive 时，获得了相当的细胞密度、IgG 滴度和 IgG 质量。灌流工艺从 2 L 实验室规模扩大到 50 L 中试规模不仅成功，而且还具有完整的在线测量控制功能。这一双重成就凸显了 Repligen ATF 系统的可放大性以及维持稳定过程控制超过 50 天的能力。灌流工艺中的高单位体积生产率可以节省成本、减小生物反应器尺寸并维持生产工厂的生产能力。或者，在仍然使用相同的生物反应器尺寸的情况下，产量可以增加 2.8 至 3.2 倍。

原文：V.Ott, J.Ott, D.Eibl, et al., Scaling Fed-Batch and Perfusion Antibody Production Processes in Geometrically Dissimilar Stirred Bioreactors. Processes, 2024.

撰稿人 | 生物工艺与技术

责任编辑 | 邵丽竹

审核人 | 何发