药物CMC开发系列之：DSC研究冻干处方及预冻工艺

袁梵雨 2023-09-25

DSC 是冻干工艺研究过程中，必备的辅助仪器之一;

前言

任何处方在开始设计冻干工艺之前，都需要 DSC对其热性能参数进行基本的测定;

但很多老师对于 DSC 的测试程序设计、图谱解读，以及解读出来的参数如何对后续工艺开发进行指导有非常多的疑问;

所以我特别约袁老师写一篇: DSC 在冻干工艺开发中的应用的文章；

读完之后，感觉醒翻灌顶，这篇内容对于实际工作真是非常有帮助；

重点中的重点是:

DSC应作为冻于处方及工艺开发过程中

非常重要的 PAT 工具来使用

而不是仅仅作为一个测试仪器

那具体如何使用，如何解读呢？

本篇文章将会详细探讨

以下内容为文章袁老师文章正文:

康老师约我写一篇介绍 DSC 的稿件，其实我内心是抗拒的，因为 DSC这种方法用得越久就越觉得不好说。

一方面是设备本身的操作很简单：

无外乎就是设计一些温度事件，即便是使用modulated DSC，看似复杂，其实也就是温度事件中温度变化是波动的，本质上并没有多大区别。而仪器灵敏度与分辨率的关系，通常也只跟升温速率相关，无外乎就是升温速率快，灵敏度高分别率低；

待检测样品除了量与信号方面的考虑也无需做其他复杂处理；

如果处理也并不复杂，大多数情况下均为定性分析，只需要知道各种转变起始值或峰值，不需要精确的计算自由能等的变化，所以转变的信号识别是否足够准确，并不是需要特别关注的事情。而这也降低了对设备程序参数设计和样品的要求。

因此，单纯的讲DSC这台设备大概怎么使用，没什么意义。

另一方面，DSC又是真的难，DSC更多情况下：不是测试型设备，而是研究型设备；

DSC正确使用方法：像做小试一样做DSC

也就是说使用DSC，不能像使用天平一样：放上去、跑一遍、读个值就行；

做DSC应该要的样子是：把它想象成一台带有PAT的小试设备，用它来模拟工艺条件，并通过热数据来清晰的解读在不同的条件下，物质的转变是怎样发生的。

这就需要做DSC的人对物质的相变有充分的了解；

但物质材料的相变可能是极为复杂的，在不同的热历程下发生不同的转变：可能结晶，可能出现玻璃化转变，可能出现亚稳态晶型（多晶型）；

其中有的材料的相变信息有充分的资料：比如纯蔗糖水溶液Tg’，比如蔗糖在溶液状态时通过降温在可观察时间内难以结晶，再比如NaCl水溶液Te；

但对于更多的一些复杂混合体系，其变化的公开信息就不是那么充分了；

而要用DSC研究不是那么清楚的变化，对于研究人员的要求就比较高。

DSC能看到哪些信息：以蔗糖甘露醇为例

同样是蔗糖和甘露醇的混合物，两者之间的比例发生变化时，甘露醇的结晶行为和其余溶质的玻璃化转变就会完全不一样：

我们先假设体系中仅有微量的蔗糖，此时几乎对甘露醇的共晶没有影响，在工业冻干机降温速率下，甘露醇几乎均能够正常成核并发生共晶转变（而在实验室条件下，可能由于降温速率过快，来不及成核即发生了玻璃化转变）；
我们再假设体系中主要为蔗糖，尽少量甘露醇。由于水结冰后，剩下的溶液处于浓缩的高粘度状态，物质扩散极其缓慢，使甘露醇无法达到成核的必要条件，所以在一般工艺可观察时间内，甘露醇无法结晶。而又由于甘露醇分子量小，所以其自身Tg’比蔗糖小，所以体系继续冷冻下去，发生玻璃化转变，但此时混合体系的Tg’高于纯甘露醇水溶液的Tg’而低于纯蔗糖水溶液的Tg’。

最后我们再假设体系中蔗糖和甘露醇以一个合适的比例（如1:2）在一个合适的速率（如1℃/min）下进行降温到-60℃。由于成核带有一定随机性，在这个速率下，甘露醇可能在冷冻的过程中发生共晶转变，也可能没有。但是当温度达到-60℃后，如果我们进行升温，将首先观察到未结晶的甘露醇和蔗糖混合物的Tg’，此时如图 1中A所示，有一个斜率的变化，温度持续缓慢的上升，会出现一个放热峰，这个峰是甘露醇结晶峰，由于甘露醇和蔗糖混合玻璃熔化，所以甘露醇重新获得动能，扩散到浓溶液和已有甘露醇晶体的表面，发生结晶。温度如果持续上升，则会看到两个吸热峰，分别对应着甘露醇Te和水的熔点。

对比图 1中B所示，B是通过退火或极慢降温使甘露醇完全结晶的图，其中只有蔗糖Tg’和甘露醇Te，而没有混合物Tg’和甘露醇结晶峰。

图 1 甘露醇蔗糖混合水溶液热图

用DSC研究预冻退火工艺：退火时间和退火工艺

因为DSC可以观测到诸如此类的相变热，所以我们可以使用DSC对物质的相变的相关特性进行测量；

但又因为物质的相变总是跟热历史息息相关——特别是对于混合物，所以我们又难以通过一个标准化的程序，对所有物质材料进行有实际价值的测试；

鉴于此，我们不如干脆直接把DSC的检测当作是一场小试，通过不同的程序的设计，来模拟预冻过程中可能出现的热历程，并借此了解预冻过程中物质状态的转变，从而实现预期的固体结构。

现在我们以含蛋白和微量表面活性剂的蔗糖，甘露醇体系为例，来说明这种研究是怎么进行的：

假设我们固定蔗糖:甘露醇比例为1:2，这个比值是经验上的临界值，也就是说如果体系中含有更多蔗糖时，甘露醇的结晶就会变得困难，以至于在工艺可操作时间内，可能是无法使甘露醇结晶的。

理论上来说，蔗糖甘露醇体系已经研究得非常充分，所以一般情况下，工艺可以直接无脑降温至-45℃，然后上升到比如-10℃进行退火，让甘露醇结晶。但实际上-10℃不是必须的，可使用的退火温度通常是一个很大的范围，只要高于Tg’而低于Te即可。也就是说-25℃也可以，-5℃也也可以，只是必要的退火时间不一样。

*需要说明的是：退火是一个宽泛的概念，实际上任何最终让晶体或固体结构发生变化的过程我们都可以认为是在退火。

例如我们可以通过退火：

让未充分结晶的物质结晶；
让晶体在固态下进一步生长；
让晶体从不稳定晶型转变为稳定晶型；
让非晶固体（无定形态）熔化释放应力或在空间中重新分布。

但本文主要讲DSC研究预冻，所以退火限定在让未充分结晶的物质结晶这一功能。至于让无定形态重新分布消除冻干中形成的盖子，让冰晶生长从而降低升华阻力等冻干相关固体物理内容，由于无法通过DSC直接研究，故不在本文讨论范围之内）

但是假设我们还是并不特别知道在应该用什么温度下退火多长时间，那我们可以使用DSC来进行研究，方法如下：

首先得到一张未退火的DSC图谱：

先跑一个未退火的程序。将样品快速降温至-60℃或者更低，不记录热数据；
以一定升温速率进行升温直至水熔化，并记录热数据。由于考虑到本文读者可能对本方法没有那么熟悉，建议以较慢速度升温，例如1℃/min；

这样，我们就可以知道这个体系下，如图 2所示，甘露醇未完全结晶时的Tg’0和Te值。

*DSC可以对降温和升温过程进行研究，冻干中一般记录升温的过程，很多冻干领域的人说这是因为DSC无法准确记录降温过程中的热事件，这是不对的，真正的原因是冻干材料相对简单，降温过程中过冷又常常造成干扰，所以为了简化问题，而只记录升温过程。

但是对专门研究结晶的领域，则更多的研究降温过程，另外有些特殊材料升温和降温中玻璃化转变温度不一样，也需要分别研究。

1. 选择退火温度和时间

如上文所述，退火温度应该高于玻璃化转变温度，低于共晶点。在本例中，也就是在Tg’0和Te之间。对于尚不熟悉的朋友，你可以尝试几个温度，不必太多（间隔5-10℃设计一个退火温度）；每个温度上尝试几个时间（推荐时间在1-3个小时之间，变动以小时记，时间间隔不必太密集）。

2.对退火进行研究

将样品快速降温至-60℃或者更低；
快速升温到设计的退火温度。由于会在该退火温度上停留较长时间，且系统能量几乎只取决于退火温度，所以升温过程不必特别在意；
保持一段时间；
急速降温至-60℃；
以1℃/min的速率升温至水熔化。这一步须记录热数据。在这一系列实验中，升温速率可以更快，这个参数不是那么重要

*当然，严格的说，玻璃化转变是比较特殊的状态转变现象是一个时间的，在少数体系中，受升温速率影响较大，极快升温条件下，可能会有几摄氏度的上升。但在本例中，升温速率影响很小。

3. 确定退火温度和时间

根据上述步骤，可以得到数张DSC图，大概的状况如图 2所示。

首先我们找到几个充分退火的条件，如果你的产品没有特别的不稳定的情况，我们一般推荐在尽可能高的退火温度下退火；

图2：DSC研究蛋白蔗糖甘露醇溶液退火条件

预冻过程中的状态变化，在实际的情况中往往更加复杂，针对复杂的情况，提供以下注意事项供大家考虑：

退火过程中可能造成的其他问题的考量

蛋白虽然通常是fragile glass，对结晶抑制比较弱，但高浓度蛋白的情况下，依然可以观察到对结晶的抑制，特别是本来蔗糖甘露醇比例就处于临界状态时，存在甘露醇无法正常结晶的可能性。

*双糖/可溶性多糖是strong glass。一般来说结构刚性规则的物质形成的玻璃比较fragile，而结构不规则表面粗糙柔性的物质形成的玻璃比较strong。

在热力学上的表现是玻璃化转变时的能量变化不同，fragile glass转变时能量变化相对较小，在DSC的灵敏度下，甚至观察不到玻璃化转变；而strong glass则会有明显的热变化，有的甚至可能出现玻璃态，高弹态，粘流态三态，在DSC上能看到两个斜率变化的区域，当然这要区别于相分离时出现两个独立的Tg’的情况。

温度的高低实际上决定了溶质在浓溶液中的扩散，所以温度越高需要的退火时间理论上更短；
但温度的高低同时又决定了冰晶表面的临界曲率；
更低温度下，曲率高的小冰晶得以保存，但是温度高于临界值时，水分子会从曲率高的小冰晶表面逃离，迁移到曲率小的大冰晶的表面实现冰晶的生长。也就是说升高温度的同时，冰晶也在发生变化；
而冰晶的变化又造成两种截然不同的效应：冰晶是升华的通道，也决定了浓溶液的比表面积，当冰晶很大时，升华的通道很大，但浓溶液比表面积很小，这导致了同样的干燥温度下，有着更高的升华速率，但是浓溶液中的水分的排除，却更加困难。
所以退火时，如果退火温度高于冷冻时的过冷点，则退火是同时对可结晶物质和冰晶同时进行退火；
对于无菌制剂生产，我们推荐同时考虑冰晶和可结晶物质的退火，因为GMP环境洁净度高，溶液中异相核少，水过冷点低，由于升华通道小，所以如果不退火，GMP生产中升华速率会明显低于小试，造成生产时间不可控；
但这个退火的过程，又要考虑到水分的增加；
由于对于绝大多数产品，实际上并不真的需要极低水分（如必须小于1%），所以可以以完全结晶和升华增速为主要目的；
对于极个别产品，需要做好不同需求的平衡。
另外，冰晶生长和升华速率提高并不是简单的线性关系，一般初期的生长提高升华速率更多，后期的生长对实际工艺时间影响较小，但对水分影响则较大，需要大家对此也进行关注。

虽然蔗糖随着水的结冰，浓度近数量级的提高，在这样的氢键网络里，绝大多数蛋白ΔGunfold也跟随着大大提高，不会发生冷变性，但少数蛋白还是会出现构像方面的问题。
蛋白就算没有构像方面的问题，但由于也经历了浓缩，所以分子间距离也明显发生了变化，对于胶体稳定性存在挑战。
虽然体系含有表面活性剂，但由于固液界面的形成，很可能使表面活性剂实际的CMC提高，从而使表面活性剂失效，导致少数蛋白有可能在界面发生解折叠，聚集，甚至蛋白颗粒形成；
同时表面活性剂的自组装，实际上也和温度有关系。同理所有的自组装，无论是LNP，还是其他nanoparticles，自组装也受温度调控，所以冷冻速率，过冷，冷浓缩，与这些自组装材料的形态均息息相关，需要考虑。
冷冻细胞时，冷冻的伤害和渗透毒性同时存在。为了让活细胞耐受冷冻环境往往会加入一些osmolytes，帮助细胞抵抗冰晶和脱水的伤害，但细胞若吸收过多的osmolytes，也会造成细胞毒效应，所以冷冻的曲线需要同时考虑冷冻伤害和渗透毒性。

可见，实际情况永远是复杂的，因此我们一直期望冻干科学家同时也是专业的formulation科学家，这样能够有更综合的判断；

但实际情况下，似乎很少有人能同时精通冻干和formulation；

但无论如何，我们至少建议在刚开始冻干开发时甚至在刚进行formulation开发时，冻干科学家就能够和formulation科学家进行充分的讨论，在产品质量能得到足够的保障的情况下，优先选择更利于冻干的formulation，从而给冻干留足工艺空间。

但实际中，总会有不理想的状况发生；

假设冻干工艺开发时，formulation无论如何不可能发生改变了。那么冻干科学家也应该通过对产品的理解平衡工艺时间，水分，API之间的复杂关系，确定退火的基本策略，并对其进行研究。但这一点已经超过了DSC研究退火工艺这个范畴，所以若以后有机会再跟大家详细讨论。

如何通过DSC去研究未知体系的凝固情况

上面是一个比较简单的例子，组分都是大家熟悉的，混合在一起后，变化行为也没有发生超预期的变化；

但对于完全不了解的体系，例如在处方含有多种物质，物质是否易结晶，Tg’，Te等均不知道的情况下；或者两种东西加在一起，Tg’，Te都突然检测不到了的情况下；

再或者对于一些提供冻干工艺开发的团队，虽然formulation平平无奇，但客户就是不愿意告诉你组分是什么，在这些情况下我们该怎么研究呢？

这些情况相对复杂，有时候难以完成研究工作，但还是提供一个基本的研究框架供大家参考：

先按照上文未退火DSC方式做一遍尝试，如果运气好能直接看到几个关键值。在这种情况下可以如上文所示进行后续研究。
如果运气不好，DSC图无法提供充分数据，可进一步做如下尝试；

先研究单一组分的相变情况

由于单一物质的Te和Tg’跟其水溶液浓度通常不相关，所以可以配一个高浓度的溶液，这样做的目的是往往能得到更好的DSC信号，特别是针对于那些fragile glass；

接着，对高浓度溶液进行DSC分析，方法如下：

将样品快速降温至-60℃或者更低，不记录热数据；
以一定升温速率进行升温直至水熔化，并记录热数据。由于考虑到本文读者可能对本方法没有那么熟悉，建议以较慢速度升温，例如1℃/min；或者更慢的速率（参考设备能力），如0.1℃/min；还可以通过每上升5℃停留1小时。具体的参数不重要，主要的目的是给结晶留下充分的时间和过冷度。

一般来说，以这种极慢或者等温孵育的方式，都能使普通可结晶辅料结晶。如果在这种情况下，依然没有Te，那就说明该物质在常见工艺可操作时间内是难以结晶的（其实蔗糖，海藻糖就是这样的例子）；

在这种情况下，我们可以只关注它的Tg’。

*研究DSC信号极弱的无定形态组分的玻璃化转变

如果不幸，Tg’也无法测到该怎么办呢？

这种情况下，说明该物质是fragile glass，那么我们可以进一步提高该物质溶液浓度，以提高信号；

但如果单提高浓度依然无法找到信号，我们一是可以放弃DSC分析，直接用FDM对其Tc进行研究；

再就是可以通过间接的方法去估计它的Tg’：

将待测物和蔗糖以不同比例进行混合，其中蔗糖绝对含量尽可能高于5%（w/v)，以得到较好的信号。
混合物Tg’m近似等于待测物Tg’x和蔗糖Tg’s在不同比例下的重量平均，例如Tg'm=(ATg’x＋BTg’s)/(A＋B)，A是待测物量，B是蔗糖量。

这个方法得到的Tg’是实用性的，因为实际上玻璃化转变和分子间相互作用关系很大，但我们选用蔗糖是因为这个分子本身比较惰性，不太发生复杂的结合和重排的关系，相对比较准。

对混合物进行研究

如果我们已经得到Tg’和Te，我们可以开始对混合物进行研究。如果物质均不发生共晶，那我们需要知道的就是混合后的Tg’，可我们已经知道原始混合条件下的混合物，没有足够好的信号，所以可以对等比高浓度溶液进行研究，或者计算，再或者和蔗糖混合进行评估。其中高浓度测试如果能得到结果最好，如果得不到的话，我们建议同时完成理论计算和蔗糖混合实验，如果两者数据接近，则相对比较靠谱。当然改用FDM研究，永远是是一个实用的方法。

研究复杂的共晶体系

如果有一个可以结晶，或两个都可以结晶，但混合后就不结晶了。那我们可以采用梯度配比的方式进行研究：

例如A是结晶的，B是不结晶的。那我们用不同比例的A和B去跑一个极慢速升温DSC，就可以找到A和B的临界比例。

而如果A和B都是可以结晶的，则我们应该用经典的共晶研究的方式去研究。在这种情况下，实际上是A/B/水三相的共晶转变；

我们可以通过研究B对A/水的共晶点影响，以及A对B/水的共晶点影响，找到A/B/水三相共晶点。

方法是配制一系列混合溶液中，使A和B的比例呈梯度变化，例如10:1, 9:1, 8:1.........1:8,1:9,1:10，建议至少要8-10组溶液，其中一半高比例A，一半高比例B。这样我们能测到8-10组共晶数据。并如下图 3一样找到混合的共晶点；

但实际情况中，某些比例混合物很难发生结晶，且Tg’极低，几乎没有冻干的空间，如果真是这样，还是建议放弃这个配方。

图 3：混合复杂体系的共晶点示意图

最后再简单介绍一下多组分混合物的研究

当组分增多时，研究工作的复杂性在急剧的增加。在实践中往往已经失去了充分研究的价值和可能性。

所以在这种情况下，推荐首先用一个极慢升温或等温孵育的方式，看看组分能不能结晶。如果有组分可以结晶，则按照前面退火的方式进行研究。如果不能结晶，则基本在工艺时间内无法结晶。

为了保证工艺的空间，还可以对formulation进行一个小的robustness的确认：

对组分中最大（一般越大越难结晶）和最小两种组分，进行浓度的调整。对于只发生玻璃化转变的样品，将大的分子的浓度降低30%，小的分子浓度提高30%；而对于可以结晶的样品，将大的分子的浓度提高10%，小的分子浓度降低10%。其他组分浓度不变。用这个溶液再一次进行极慢升温或等温的测试，如果还是和之前的现象一致，则实践中的风险就比较小。