灭活病毒性疫苗为通过化学、热处理或辐射处理经培养纯化的病毒性疫苗，其主要优点是：与活病毒疫苗相比更稳定和安全，不会发生因疫苗接种而导致的感染；被灭活但仍可被机体的免疫系统识别，并产生有效的免疫应答；可用于免疫系统相对较弱的个体；稳定性较好，无需冷冻，方便运输。其缺点主要为免疫原性相对较弱，一般需进行多次接种。

目前已经上市的灭活病毒性疫苗主要有脊髓灰质炎灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、流感病毒灭活疫苗、人用狂犬灭活疫苗、乙型脑炎灭活疫苗、双价肾出血热灭活疫苗（表1）[1]。

目前国内外灭活病毒性疫苗的细胞基质主要为人二倍体细胞、原代细胞、鸡胚细胞和Vero细胞。其中人二倍体细胞主要有2BS 株、KMB-17 株、WI-38 株和MRC-5 株。各种细胞的特性不一样，培养方式也不一样。人二倍体细胞传代比例和传代代次比较受限，不利于大规模细胞培养，且对培养基和牛血清质量要求较高。原代细胞主要有地鼠肾细胞、沙鼠肾细胞，操作繁琐，存在外源因子污染风险。人二倍体细胞和原代细胞的培养方式主要为转瓶、细胞工厂，这两种培养方式较为传统，每批培养体积较小，较为费时费力，其生产规模仅仅是转瓶或细胞工厂数量上的增加，难以规模化放大。

Vero细胞是第一个可连续传代的哺乳动物细胞，来源于非洲绿猴肾细胞，目前广泛用于疫苗的生产，为灭活病毒性疫苗常用的细胞基质。国内外主要采用微载体生物反应器进行Vero细胞培养。与细胞工厂培养方式相比，微载体生物反应器培养具有明显的优点：可进行高密度培养；可保证细胞在规定细胞传代限定代次内进行分级放大，易于进行规模化放大。国外已有企业建立了在8 周内从1mL 安瓶到6000L 生物反应器的Vero细胞放大生产工艺，在整个规模化放大过程中Vero细胞的产量和活性并不降低[2]。表2 显示了不同反应器规模细胞培养的生长状态。从中可以看出，在反应器内进行15 ～ 6000L 规模化放大培养时，Vero细胞密度体现较好的一致性[2]。

正是由于Vero细胞在病毒性疫苗生产中的应用，使得现代病毒性疫苗的生产进入工业化、规模化时代，生产过程更加可控，批间一致性更好。目前国内外主流的以Vero细胞为基质的疫苗生产均采用微载体生物反应器培养工艺。

以Vero细胞为基质生产的灭活病毒性疫苗主要有脊髓灰质炎灭活疫苗、狂犬病灭活疫苗、日本乙型脑炎灭活疫苗，目前Vero细胞还被用于小儿轮状病毒活疫苗Rotateq1（Merck）和Rotarix1（葛兰素史克）[3]、H5N1大流感疫苗Preflucel1（Baxter）[4]、日本脑炎疫苗Ixiaro1（Intercell）的生产[2]。此外，还被批准用于天花活疫苗ACAM20001（Sanofi Pasteur）的生产[2]。

Vero细胞等传代细胞培养均采用含血清培养，但含血清培养对于病毒性疫苗的下游纯化也有较高的要求，需要严格控制血清中BSA的含量、纯化的回收率等一些关键的指标，所以无血清细胞培养技术成为国内外细胞培养研究热点之一。Vero细胞的研究的另一个热点是进行细胞悬浮化高密度培养。与使用微载体不同，细胞进行悬浮化培养后，细胞的贴壁特性发生了改变，细胞不需要消化可直接传代，并且可以提高细胞的发酵密度。

国内外的灭活病毒性疫苗均需要经过收获、澄清、浓缩、纯化、灭活等生产工艺。其中纯化主要采用柱层析或蔗糖密度梯度离心法。这两种方式各有优缺点：层析法便于线性放大，批间一致性较好，但是试剂成本较高；蔗糖密度梯度离心法纯化的抗原成分单一，可有效区分空心和实心病毒颗粒，但每批处理量较小，后期需要除糖处理。国内外上市的灭活病毒性疫苗多采用层析纯化工艺。

目前病毒灭活主要采用β-丙内酯和甲醛两种灭活剂。β-丙内酯常温下是无色黏稠状液体，主要通过作用于病毒RNA从而达到灭活病毒的效果。目前上市的疫苗中采用β-丙内酯灭活的主要有狂犬疫苗和双价肾出血热灭活疫苗。

在疫苗研究初期人们就已使用甲醛进行细菌和病毒性疫苗的灭活。甲醛对于病毒核酸和蛋白质都具有破坏作用。甲醛对单链核酸的破坏最为有效，因此常被用于RNA 病毒的灭活。脊髓灰质炎灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、流感病毒灭活疫苗、乙型脑炎灭活疫苗等均采用甲醛灭活工艺。

2.1.1　肺炎球菌结合疫苗

目前，全球已上市的肺炎球菌结合疫苗有3 种，分别是惠氏（Wyeth）公司生产的7 价肺炎球菌结合疫苗Prevnar7（2000 年上市）和13 价肺炎球菌结合疫苗Prevnar13（2010 年上市），以及葛兰素史克公司生产的11 价肺炎球菌结合疫苗Synfl orix（2009 年上市）[6-8]。

（1）Prevnar

Prevnar7 配方中包括了4、6B、9V、14、18C、19F、23F 共7 个血清型的结合物，Prevnar13 包括了1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F 共13 个血清型的结合物，比Prevnar7 多6 个型别的结合物（1、3、5、6A、7F、19A），两者均以CRM197 为载体蛋白，均为磷酸铝佐剂吸附剂型。惠氏公司结合物制备采用的工艺路线为：将天然多糖进行酸水解降低分子量至适宜范围（有些型多糖在氧化反应中自行降解，不需要预先进行水解），用高碘酸钠氧化多糖邻羟基使多糖重复单位产生醛基，醛基与CRM197 分子上的氨基，在还原剂（如NaBH4）存在的条件下发生还原胺化反应生成酰胺键，该方法被称为还原胺化法。这种方法的优点是对多糖重复单位上的邻羟基进行可控的修饰，不破坏多糖分子的其他结构，易于质控。缺点是还原胺化反应需要的时间较长，有的型结合反应需要5d。在0.5mL Prevnar13 中，有12 种血清型多糖各2μg，4μg 6B型多糖，0.125mg 磷酸铝佐剂。Prevnar13的剂型为不含胶乳的单剂预充式注射器灌装注射液[9-10]。

（2）Synfl orix

Synfl orix 配方包括1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F 共10 个血清型结合物。该产品使用了3 种不同的载体蛋白，其中1、4、5、6B、7F、9V、14、23F 载体蛋白为不可分型流感嗜血杆菌表面蛋白D（PD），19F 载体蛋白为白喉类毒素（DT），18C 载体蛋白为破伤风类毒素（TT）。剂型同样为磷酸铝佐剂吸附剂型（0.5mg 磷酸铝佐剂/ 剂）。每剂疫苗含1、5、6B、7F、9V、14、23F 这7 个血清型多糖各1μg，4、18C、19F 各3μg。所采用的技术路线为对除5、6B、23F 这3 个型外的其他天然多糖分子进行微流化（microfl uidization）处理以降低分子量，在不同条件下用1- 氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐［1-cyano-4-（dimethylamino）pyridinium tetrafl uo-roborate，CDAP］将多糖的羟基活化为氰酸酯，活化后的多糖的氰酸酯通过与载体蛋白或己二酸二酰肼（adipicdihydazide，ADH）衍生的载体蛋白的氨基或肼基形成异脲衍生物而实现结合。其原理与传统的溴化氰活化法相同，但活化条件更加温和，活化物副反应发生率低，对多糖的结构改变较少。与还原胺化法相比，耗时少。此方法的缺点是活化时间仅几十秒，要在这几十秒内对溶液迅速变化的pH 进行控制并不容易，由于多糖活化和结合是连续完成的，难以对多糖活化进行有效质控，反应条件偏碱性，对多糖上碱性条件敏感的基团难免会造成破坏，结合载体蛋白利用率不高[11]。

2.1.2　脑膜炎球菌多价结合疫苗

当前国际上脑膜炎球菌结合疫苗的发展趋势为包含A、C、Y、W135 等4 个血清群的多价结合疫苗，目前全球已上市的有3 家产品，分别为赛诺菲巴斯德的Menactra、诺华的Menveo（2014 年被葛兰素史克收购）、葛兰素史克的Nimenrix。

此外，还有一种联合疫苗，葛兰素史克的C、Y 群脑膜炎球菌与b 型流感嗜血杆菌结合疫苗，其产品名为Menhibrix。

（1）Menactra

液体剂型，2005年获得批准上市，规格为0.5mL，其中含A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖各4μg，含载体蛋白白喉类毒素DT约48μg。

其基本工艺路线为：①用弱酸和双氧水水解多糖，制备多糖水解物；②各群多糖水解物分别按照不同工艺进行衍生（A 群衍生物为多糖溶液中加入EDAC 和ADH，在A 群多糖的磷酸基团上连接肼基。C 群、Y 群、W135 群衍生物为利用氰基硼氢化钠将ADH 与多糖的末端醛基结合，衍生出肼基。然后多糖衍生物溶液加入EDAC，直接与DT 结合）。

（2）Menveo

2010 年获得批准上市。A群为冻干剂型，C、Y、W135 群为液体剂型，规格为0.5mL。每剂含A群多糖10μg，C、Y、W135 群多糖各5μg，载体蛋白为CRM197 蛋白。

其基本工艺路线为：首先多糖用弱酸水解为分子量约为12 ～ 16 个重复单位的片段；在还原剂作用下，将多糖的末端醛基还原成氨基；然后经酯化产生末端活性酯基团；最后与CRM197 结合[12]。

（3）Nimenrix

2012 年获得批准上市，为冻干剂型，蔗糖作为赋形剂。每剂含A、C、Y、W135 群多糖各5μg，载体蛋白为破伤风类毒素。

其基本工艺路线如下。①将荚膜多糖进行降解。②采用氰基活化法活化多糖。③ A 群和C 群结合：多糖用CDAP 活化后与ADH 进行衍生，然后与TT结合；④ Y 群和W135 群结合：用CDAP 活化后直接与TT 结合。

（4）Menhibrix

2012 年获得批准上市。为冻干剂型，赋形剂为蔗糖。每剂含b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖2.5μg，C、Y 群多糖各5μg。载体蛋白为破伤风类毒素。每剂含12.6mg 蔗糖。

2.2.1　13 价肺炎球菌结合疫苗

国内企业尚无上市的产品，当前进度领先的为玉溪沃森，已经完成Ⅲ期临床疫苗的接种工作，兰州生物正在进行Ⅱ期临床研究，民海生物也已进入了临床研究。

2.2.2　AC 群脑膜炎球菌结合疫苗

我国在20 世纪80 年代已开始研发A 群脑膜炎球菌结合疫苗（TT 为载体），上海生物制品研究所采用的先将蛋白质衍生后与多糖偶联的工艺，动物实验表明该法可增强结合物中多糖的免疫原性[13]，但研究未能进一步持续下去。后来国内多使用先将多糖衍生，再与蛋白质载体偶联的方法研制脑膜炎球菌结合疫苗。

2006 年以来我国先后有4 家企业的AC 群脑膜炎球菌结合疫苗获准生产（表3）。这些产品都以TT 为载体，每剂每群多糖含量为10μg，以乳糖为保护剂；均采用氰基活化法进行多糖的衍生；结合物都采用柱层析纯化工艺。

表3　我国已上市的AC 群脑膜炎球菌结合疫苗

2.2.3　ACYW135 群脑膜炎球菌结合疫苗

ACYW135 群脑膜炎球菌结合疫苗在国内尚未形成上市产品，据统计，国内已有6 家企业获得临床研究批件并进入临床阶段。进度最快的已经完成Ⅲ期临床研究，正在进行数据统计。

基因工程疫苗是指使用DNA 重组技术，改造病原微生物的基因组，以降低其致病性，提高其免疫原性；或者将病原微生物基因组中的一个或多个保护性抗原编码的基因片段克隆到表达载体，通过原核或真核表达系统诱导表达外源蛋白，经纯化等工艺步骤制成疫苗，接种动物产生保护性抗体，达到防治传染病的目的。近年来，随着分子生物学、反相遗传学和结构生物学等理论研究和技术方法的不断突破，以及专业仪器的不断升级，基因工程疫苗的进展也日新月异。目前利用基因工程技术已经使用和正在研制开发的新型疫苗主要有基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、转基因植物疫苗等，这些疫苗统称为基因工程疫苗。与传统疫苗相比，基因工程疫苗具有如下诸多优势：①抗原成分明确，表达通路清楚可控，安全性高；②生产成本低，工艺步骤稳定，易于规模化放大；③质量控制的方法和标准具有一定通用性，从而提高安全性；④通过载体或抗原蛋白的上游设计，可构建能够对多种疾病产生保护的多价疫苗。现在基因工程疫苗已成为生物制品产业发展的一种趋势，在各种疾病的防控方面发挥重要作用。

基因工程疫苗的生产技术流程包括四个步骤：上游保护性抗原/ 表位和表达载体设计，基因工程菌/ 细胞构建，大规模发酵培养，目的蛋白纯化。基因工程蛋白的研发和规模化生产进入门槛高，尤其是建立工业规模生产平台，需要技术、人才和资本的多年积累。其中，高表达工程菌株/ 细胞株的构建和下游生产纯化工艺是关键技术[14]。以提高单位制品产量、细胞高密度培养及表达[15]、简化生产工艺、降低生产成本、保证大规模生产制品质量为目的的核心工艺开发已成为各大生物公司竞相开展的前沿课题。

中国生物医药企业起步于20 世纪80 年代初期，经过30 年的努力，生物医药产业取得一定发展，生物产业已初具规模，在发展中国家属于较高水准。但我国疫苗的规模化生产工艺研究起步较晚，大多处于半自动化阶段，其根本原因在于，研发人员在“研究和生产的关联意识”和“质量源于设计”等理念上认识的差距，致使初期的研发设计与规模化生产制备脱节。临床前期的研究很少考虑到工艺的可放大性和终产品质量的可控性。制备工艺往往仅限于实验室规模，不适合规模化生产。如纯化工艺中，实验室研究阶段广泛的采用超速离心和亲和层析法，均为间断性操作且费用较高，很难应用于生产。随着国外疫苗研发和生产企业在国内广泛设厂投产及国内疫苗质量控制监察体系的不断完善，这方面差距在逐渐缩小。此外，疫苗生产用表达系统和宿主细胞方面，国外的研发机构通常拥有专利技术保护，具有相对成熟的技术储备；规模化生产的仪器设备方面，无论是高密度发酵的生物反应器还是规模化分离纯化的层析介质、膜分离技术[17]，几乎所有的关键仪器设备都依赖进口，这极大地限制了我国疫苗规模化发展的进程。

基因工程疫苗领域重点在于上游设计，在疫苗研发初期综合考虑工艺放大可行性、质量可控性甚至厂房和设备需求，可迅速实现规模化生产占领市场，同时降低生产成本，提高生产效率，确保安全。因此，相比传统疫苗，我国的基因工程疫苗更容易在产业化能力方面与国际接轨。