在清洁验证中，为确保验证达到预期⽬的，设备确认主要是对清洁工艺中使⽤的设备进⾏确认，例如CIP模块和⾃动清洗机。对于刷洗、擦洗等全手工清洗操作，则不需要进⾏设备确认。此外，设计和开发阶段的设计确认是另一种的确认活动。下面重点讨论工艺确认活动，工艺确认指按照设计方案完成的⽤以证明清洁工艺一致性的所有活动。传统的清洁验证注重证明清洁工艺的有效性和一致性。但是在制药工业领域引入生命周期⽅法提出了更加全⾯的观点，它将确认活动视作整个验证中的一个阶段。生命周期的验证⽅法还包括前期设计、开发活动和验证的持续维护（持续控制）。内容包括清洁验证⽅案要素和验证⽅案中关键点，包括验证次数、验证中的模拟污物、最差工艺条件和验证期间设备/产品处置。此外，还包括产品和生产设备的分组⽅法、清洁保持时间研究要点以及对“清洁效果确认”⽂件的讨论。

验证方案要素Protocol Elements

清洁验证⽅案要素与工艺验证⽅案相似。为便于表述，特定公司的清洁验证⽅案通常采⽤与工艺验证⽅案相同的模板（适当时），一般包括（但不限于）验证⽬的、验证设计/策略、验证范围、职责、适⽤产品和设备、清洁程序和相关⽂件、可接受标准、⼈员培训和最终验证报告的要求。清洁验证⽅案中关键要素包括允许残留限、取样程和分析⽅法。

有两种⽅法可⽤于组织和编写验证⽂件，常见的⽅法是引⽤其他⽂件相关要素的详细内容。例如，将擦拭取样布点写在验证⽅案中，⽽取样点的选择依据在另一个⽂件中，则可以在验证⽅案中引⽤该⽂件的相应内容。由于⽅案中只需要详细说明项⽬需完成的操作，相关⽀持信息引⽤即可，这种编写⽅法可以使⽅案更加流畅。

另一种⽅法是将⽅案特定要素的所有相关信息全部描述清晰，验证⽅案执行者可直接获取明确的信息。企业应当根据⾃⾝的知识管理系统选择适当的⽅法。

验证关键点Key Protocol Issues

清洁验证⽅案应在清洁工艺设计和开发后起草和批准，并在获得批准后实施。在某些情况下（如操作⾼度复杂或⽅案执⾏者⾸次实施的活动），可以先模拟实施验证⽅案。在模拟验证中发现的任何问题均可在实际验证实施前纠正。这种模拟有助于提⾼正式验证的一次成功率。

下⾯对验证中的关键点进⾏讨论（残留限值、分析⽅法和取样程序不在本次讨论之列）

验证次数Number of Runs in a Protocol

传统的清洁验证要求评价连续三次清洗活动。“连续”意味着没有充分理由，必须连续完成相同的清洁工艺，不得中断。例如产品A清洗验证实施过程中不可以穿插生产和清洗产品B。

基于验证生命周期⽅法以及其他几个法规如2011年美国FDA颁布工艺验证指南，提出一种新的验证⽅法。基于对清洁工艺的充分理解、设计和开发阶段记录和足够相似清洗工艺的数据，该⽅法提供了确定需要完成的验证次数的依据。清洁验证次数可少于三次，也有可能多于三次。应该认识到，虽然FDA新的工艺验证指南并不涵盖清洁验证，但是指南中的一些原则可⽤于清洁工艺的验证。

模拟污染Mock Soiling

通常情况下，清洁验证需要在产品商业规模生产时进行。还有种⽅法是在启动清洁工艺时采⽤“模拟污染”或者“⼈造污染”模拟所生产产品在商业生产设备上的特性和状态。使⽤这种⽅法时，必须提供“模拟污染”的依据，并说明它如何模拟“实际”生产状态。常见的原因是采取模拟污染的⽅式可以完成三次连续的清洁验证活动，⽽⽆需生产三批次商业规模产品。应将“模拟污染”（一个过程）同“模拟污物”（也称作污物替代物）区分开来，模拟污物是一个产品，⽤来模拟生产中真实污物的理化性质。

最差工艺条件Worst-Case Process Conditions

在设计传统的清洁验证⽅案时已经考虑到需在最差工艺条件下完成三次验证，评价最差工艺条件的原则应包含或引⽤在验证⽅案中。例如，最差工艺条件可包括最长的生产后保持时间、阶段性生产中最⼤批量或者最长运⾏时间、最短的手工清洗时间、最低的手工清洗⽤⽔温度和最差的CIP模块循环回路。

由于⾃动清洁工艺中温度、清洁剂浓度、流速和工艺步骤运行时间等参数一般控制在一个狭窄的范围内，所以采⽤参数的上下限进⾏清洁工艺挑战验证是不合适的。清洁工艺开发研究时，可以通过挑战规定范围内极限值或者超出范围的参数来证明所建⽴清洁工艺的耐⽤性。

有多种⽅法可⽤来确定最差清洁条件，一种⽅法是在每一清洁验证批次均采⽤最差清洁参数。另一种⽅法是在清洁工艺设计和开发过程时针对一个特定最差条件进⾏研究，这样开发的清洁工艺已经涵盖了最差条件。这种设计和开发研究中获取的数据有助于减少采⽤最差条件的验证批次

另一类的最差条件是在阶段性生产后进⾏清洁验证，批次之间不进⾏清洁或者仅进⾏“⼩清洁”（例如固体生产时真空吸尘或者液体生产时的⽔冲洗）。在这种情况下，最多连续生产批次即为最差条件，因此验证⽅案应考虑阶段性生产时最多批次的影响。

采⽤这一⽅法，安排具有相同批次的三个连续阶段性生产并不可⾏。一个解决办法是在生产指定批次（可代表最⼩阶段性生产批次）后进⾏清洁验证。如连续生产批次超过该指定数量，则应对更长的连续生产批次进⾏清洁验证。然后对⽐分析前后两次验证数据是否一致，是否需要额外的验证来延长阶段性生产批次。

第三类⽅法在设计和开发阶段对阶段性生产批次进⾏研究。如果有实验数据和原理能够证明阶段性生产批次不影响清洁难易程度，清洁验证过程中就可以任意选择阶段性生产批次进⾏验证。

验证期间产品和设备的处置 Disposition of Products and Equipment during Validation

一个清洁工艺通常只影响已清洁设备中生产的下一个产品，因此，按照验证⽅案执⾏后，可按照产品放⾏程序对所生产产品进⾏放⾏。产品的放⾏与生产后的清洁过程数据⽆关，清洁过程所获得数据可⽤于已清洁设备的放⾏。

清洁验证中，清洁后的生产设备有多种处置⽅法。一种⽅法在确定本批次清洁验证数据符合要求（包括符合所有残留限度）前该设备不得放⾏使⽤，设备放⾏后⽅可⽤于该产品或其他产品的生产。

另一种⽅法是在符合公司风险控制程序的前提下放行设备，用于生产下一产品。但该产品需等到该批次清洁验证数据符合要求（包括符合所有残留限度）后放⾏。如果该批次清洁验证不符合要求，那么作为该“不符合”调查的一部分，应评估其对该产品的影响。调查的结果将决定该产品能否放⾏。

如果一条生产线中的不同设备需单独进⾏清洁验证，那么每一设备都可以基于特定批次清洁验证数据放行使用，⽆需等待所有设备均验证成功。

分组/分类的⽅法Grouping/Family Approach

分组法是综合考虑所有产品/设备后对其进⾏分组，选取组内代表性的产品/设备来替代整组进⾏验证的策略。用来作为代表的产品或者设备通常是组内最难清洗的。分组法也被称为矩阵法、分类法或交叉法，它是一种运用风险分析的⽅法在清洗验证中选择最合理的验证⽬标的⽅法。分组的原则是划分为一组的产品和设备必须采⽤同一清洗工艺。运用产品和设备分组的⽅法可以在简化清洁验证程序的同时⼜获得⾜够有效的数据来支持所验证的程序、工艺步骤和设备达到预期。特定工⼚或企业的分组⽅案应当在一个精⼼设计的验证计划/验证主计划中予以明确或引⽤(例如索引⾄一个关于工⼚清洗验证原则的⽂件)。

产品分组Product Grouping

可以将在同一或者等同设备上生产，同时清洁工艺⼜相同的产品定义为一组。组内产品相对可清洁性有多种⽅法来评价。活性成分、辅料和/或降解产物的特性都会影响相对可清洁性。例如可选择API在清洁溶液中最难溶解的产品，进⾏相对可清洁性的评估。在使⽤溶剂清洗合成的⼩分⼦API或者清洗⽔溶性配⽅的制剂时，这种⽅法⽐较适⽤。此外，如果固体制剂产品中辅料部分（赋形剂）对清洁难易程度具有相同影响时，也可以采⽤这一⽅法。

另一种⽅法是通过实验室研究确定相对可清洁性，采⽤材质试样或设备⼩部件表⾯，评估可清洗性，由于不锈钢设备在制药⾏业⼴泛使⽤，一般选择不锈钢材质的部件进⾏研究。材质试样的表⾯粗糙度应该与生产设备表⾯相似或者更加粗糙（作为最差条件）。根据实验室研究结果，确定每一产品的相对可清洁性，通常采⽤推荐的清洁工艺参数确定哪个产品清洁耗时最长。此外，产品的生物活性和临床药理活性也应该作为代表性产品选择的依据。

产品分组的另一个⽅法是引⼊一种最差条件产品替代物。通常，⽤作替代品的物质是⼈工创造出的（可能不是商业产品），它⽐组内其他产品更难清洁。这种⽅法的一个优点是可以保证组内最差产品的延续性（如选择上市产品，存在停产的可能)，另一个优点是可以降低引⼊新的最差产品时重新验证的可能。

采⽤代表性产品（最差条件产品）进⾏确认。最差条件产品的最低可接受残留限值可作为组内所有产品最严格的可接受标准。代表性产品（最差条件产品）清洁验证的成功同样意味着组内其他产品的清洁工艺已验证合格。但基于风险评估(包括质量风险和商业风险)，一种⽅法是组内的其他产品都进⾏一批次清洁确认；另一种⽅法是同时选择组内最难清洁产品和允许残留限值最低的产品进⾏验证。

设备分组Equipment Grouping

设备分组要求组内设备相似，并且清洁工艺相同。在清洁验证中，设备分组是一种将需清洁验证的设备合理分组，避免多余测试的有效⽅法。分组策略是以设备设计、操作模式和可清洁性的“等同”或“相似”为基础的。判定设备是否“等同”或“相似”，需要对设备确认进⾏评估，如果设备确认的差异不影响清洁工艺，在可判定两个设备在清洁⽅⾯是等同的。法规如美国FDA颁布的SUPAC指南（药品放⼤和批准后变更指南）有助于“等同性”判定。

一旦将设备划分到指定组，就可以对这个组的验证要求进行定义。当组内设备均等同时，组内等同设备的任意组合进⾏验证。假如有⾜够的证据证明组内设备等同，就没有必要对组内每个设备进⾏验证。当组内设备相似时，可以选择最难清洁或者通过交叉法选择。例如⼤⼩相同，但内部隔板数量较多、结构复杂的罐⼦就是最难清洁设备；⼤⼩不同的设备，最⼤和最⼩两个规格（两个极端）均作为最难清洁设备（除⾮最⼤和最⼩中有一个可以作为最差条件）。如没有最差条件设备或者没有采⽤交叉法确定代表性设备，可以选择组内任一设备进⾏验证，组内其他设备（⾮最差条件）完成清洁确认即可（也许只需进⾏一个批次)。

容器、⼩部件以及较⼩设备等⼩设备分组时，也可以采⽤设备分组的⽅法评价和验证这些部件的清洁工艺。分组时可以通过对⽐⼩设备的复杂性、尺⼨和功能，来选择最难清洁的部件。

组内引⼊新产品或设备Introduction of a New Product or Equipment into a Group

向已验证过的组内引⼊新产品，需使⽤与最初确定最难清洁产品时相同的科学风险评估过程进⾏评估，例如评估产品在清洁溶液内的溶解性、进⾏实验室材质试样研究和/或者其它的清洁工艺研究。假如每新增一个产品都进⾏实验室测试应采⽤适当的对照，如最差条件产品进⾏研究。通过⽐较新产品和组内产品的相对可清洁性来确定引入新产品的验证需求。⽽新产品与前最差条件产品的相对可清洁性，以及组内产品最低允许残留限值的变化都决定着验证要求。基于书⾯的风险评估，组内新增较容易清洁品种一般只需要在实验室和/或中试放⼤研究时确认其容易清洁或进⾏一批次清洗确认即可；组内引入更难清洁品种则需要对新最差条件品种进⾏清洁验证。

基于风险的考虑，组内新增等同的设备时，可确认新旧设备是等效的，或者需要额外进⾏一个批次清洗确认即可。当组内引⼊相似的生产设备，需要评价新设备是否形成最差条件或新的交叉法极端条件，如果不是，则应特别注意新设备第一次商业生产后的清洁后效果确认，确认清洗工艺有效；如果形成新的最差条件或交叉法极端条件，新设备需按照原先最差条件或交叉法极端条件设备的验证要求重新完成清洁验证。

“清洁效果确认”⽂件“Cleaning Verification” Documentation

在本技术报告中，“清洁效果确认”是指⽤来证明生产设备经一次清洁操作后可以⽤于后续生产的⽂件。对于“清洁效果确认”，不同企业用语各不相同。清洁效果确认适⽤于如临床样品生产后的清洁，或者出现偏差（如超出了规定的生产后保持时间）影响了清洁工艺验证状态。

除了清洁效果确认针对一次性清洁活动，清洁效果确认的记录与清洁验证相似。从合规的⾓度来看，清洁效果确认数据只⽤于证明一次的清洁效果符合要求（尽管从科学⾓度来说数据可暗示重复清洁能够得到相似效果）。另一个区别是由于清洁效果确认通常是针对一次单独的清洁活动，在进⾏清洁活动前可能只进⾏了有限的清洁设计和开发。一种⽅法是建⽴一个清洁SOP和一个清洁效果确认⽅案。另一种⽅法是在一个SOP中明确规定清洁效果确认活动的各项要求，并在批准的表格中记录所进⾏的活动、取样点位置等。需要指出的是，将三个批次清洁效果确认看做“清洁验证”是不合适的，尤其是在缺少适当设计和开发工作的前提下。

The Basis for Quantitative Limits 定量限度的确定基础

Limitsare usually based on one of the following as described in later sections:限度通常基于以下几点建立：

•       Themedical or pharmacological potency of the drug active 活性成分的医学或药理效力

•       Thetoxicity of the residue 残留的毒性

•       Adefault value 默认值

 

不同的生产和清洁过程可能采用不同的方法。例如，对于体外诊断试剂，残留对后续生产产品稳定性或性能的影响可作为确定限度的科学依据。下节讨论了计算残留的基本要求。生产企业不同，这些计算的表述也不一样，因为这些计算包含了下述不同步骤。然而，关键是公式中采用的单位应一致，因此这些公式中可能用到单位转换因子（如将克转换为微克）。另外，对于同一个概念，不同生产企业可采用不同术语，但计算中应用的基本原则是相同的；这在清洁验证领域是常见的。

Sampling Method Selection取样方法的选择

取样方法的选择取决于设备、待检测残留物的性质，残留物限度以及所需的分析方法。这里讨论的取样方法包括：

•Direct surface sampling直接表面取样

•Rinse sampling冲洗取样

•Swabbing擦拭法

•Placebo sampling.安慰剂取样法

需要注意的是，虽然相关规范性文件将擦拭法称为“直接”取样方法，冲洗法称为“间接”取样方法，但更具有可操作性的描述是将这些取样方法称为“擦拭取样”以及“冲洗取样”，而对于目检等技术则保留了“直接取样”的术语。

在大多数法规文件中，擦拭法，冲洗法以及目检都是可以接受的取样方法。这些方法有其它们自身的优点与局限。在一个给定的验证方案中，为了充分确认设备清洁是可接受的，可以采用多种取样方法，例如“冲洗取样与目检结合”或者“冲洗取样，擦拭取样以及目检相结合” 。

Rinse Sampling冲洗法取样

冲洗法取样是指在相关设备表面采用流动的溶剂（水，含水溶液，有机溶剂或者水/有机溶剂混合物）去除残留物，然后再检测冲洗液中残留量。冲洗样本的采集应考虑溶解度，位置，冲洗时间以及冲洗体积。冲洗取样的一种方法是在最终冲洗过程中“抓取”冲洗溶液的最后一部分作为样品。一个“抓取”样本是从冲洗液中收集单一样本，能够代表此时冲洗液的组成。本指南中，一个“抓取”样本一般指从在线清洁的最终冲洗部分取出的单一样本。

第二种冲洗取样方法是在冲洗过程结束后，单独进行冲洗取样。这个单独的取样包括向设备中加入一定体积的溶剂，搅拌使冲洗液中残留物分布均匀。然后取出冲洗溶液样品进行分析。这个单独的冲洗取样可以是一个单独的CIP冲洗取样，这涉及了一个单程冲洗取样或循环冲洗取样。对于一个单程的独立冲洗取样，必须收集全部体积的冲洗溶液，搅拌至均匀，然后进行分析。对于循环的独立冲洗取样，冲洗样均匀性通常可以通过循环过程实现。

两种冲洗取样方法的优缺点如表所示 

表“抓取”取样与独立冲洗取样的比较

	最终冲洗过程“抓取”样本	独立冲洗取样
优点	•  代表通常的清洁过程 • 不需要额外的冲洗溶剂 •  不需要额外操作，设备即可进一步使用	•  结果容易用来计算残留量 • 体现清洁结束后残留在表面的污染物 •  如果操作正确，更更容易获得合格的结果 •  循环冲洗回收率更高 •  可以采用其他样品溶液，而不是清洁工艺冲洗溶液
缺点	•  样品代表了可能转移至下批产品的残留的最差条件，因为它反应了最终冲洗液中的残留量，而不是最终冲洗后的表面残留（但是可以证明清洁工艺的耐用性） •  残留量计算需用到“假设”	•  需要额外的步骤 •  需要额外的冲洗溶剂 • 冲洗剂加入方式可能带来污染

冲洗法取样的优缺点如表所示 

Table Advantages and Limitations of Rinse Sampling表冲洗法取样的优点及局限性

Advantages优点	Limitations局限性
•   冲洗过程中，所有产品接触的表面是湿润的。一个分析结果可以代表冲洗液中所有被移除的残留物的总和 •   如果使用工艺溶剂，取样过程不会污染设备 •   取样后无需重新清洗 •   适用于无法采用擦拭取样的区域 •   适合在线分析 •   Less technique  dependent. 更少的技术支持 • 适用于活性成分、清洁剂、生物负载 • 可对独特（如多孔的）表面，膜和树脂进行取样 •  有助于清洁工艺的设计/开发	•   只能检测到溶于冲洗溶剂的残留物 •   必须确保冲洗液接触到所有表面以充分检测残留物 •  无法检测从设备的某一部位优先转移到下一个产品中的残留物 •  样品稀释，可能无法检出 •  残留的分布位置信息有限 •   冲洗量对于获得准确结果非常关键 •  通常仅限于冲洗整个设备，比如一个容器（除了提取取样法） • 对旧设备而言，是否有设备取样口或者取样口飞否容易接近可能存在问题

 

Rationalesfor the use of rinse sampling include the following:使用冲洗法取样的理由如下：

•Equipment not accessible for other types of sampling无法采用其他取样方法（设备表面不易接近）

•The residue is volatile, so measuring it on dried surfaces is not appropriate残留物易挥发，因此不适合在干燥表面取样检测

•Rinse sampling adequately measures residues on surfaces.冲洗取样能够充分检测到表面的残留物

 

 Extraction Rinse Samplingfor Small Parts小部件提取冲洗取样法

小部件取样是冲洗取样的一个特殊情况。这些部件可以通过擦拭取样也可以采用冲洗取样。冲洗取样的一种类型是从小部件上提取残留。在提取过程中，将提取溶剂放置在一个干净的容器中，该容器足够容纳被取样部件。将小部件置入提取溶液中，搅拌或超声处理一定时间。然后分析样品溶液中的残留量。另一种类型的小部件冲洗取样通常适用于有小孔的部件，如灌装针头。在取样过程中，一定体积的冲洗液流经腔体后被收集到一个干净的容器中。搅拌样品溶液至均匀，分析其中的残留物。由于可以精确得到表面积和取样体积，因此可以准确地计算出残留的限度。

 

Solvent Reflux Sampling溶剂回流取样法

第二种特殊的冲洗取样方法是有机溶剂回流取样。在这个过程中，将易挥发有机溶剂加入到反应器中。加热至溶剂蒸发。溶剂蒸气凝结在生产设备的上部不同部位，溶解所有可溶性残留物后将其带回反应器中。尽管溶剂分配到设备表面进行取样的技术不同，冲洗取样的基本原理依然适用。

Considerations forDeveloping Limits限度设定要点

本技术报告中的产品可以是制剂、原料药、中间体或其他类型配方。如果特意指“制剂”，应采用相应的术语。

设备上残留物可转移至后续生产的产品中。因此了解可能存在的残留以及可能被污染的产品就十分重要了。而且，清洁过程的本质也很重要。一旦已经考虑到这些方面，重要一点就是获得对清洁工艺的认识（如通过流程分析），再通过风险评估对限度进行适当评价。

后续生产产品相关信息包括，产品的性质（制剂、原料药或中间体）、处方、质量标准、剂量、给药途径、批量、共用设备。产品质量标准可能是重要的，如建立生物负载限度。已清洁产品相关信息包括，处方、剂量、毒性、给药途径。清洁工艺相关信息包括，清洁剂、清洁方法、各清洁参数（见清洁工艺的设计和开发）。

Introduction of New Productsto a Validated Cleaning System将新产品引入到已验证的清洁系统

当工厂引入新产品或明显不同的原料时，应有系统确保清洁程序仍然有效。 

通常，可进行相关材质试样试验测试现有清洁系统应用于新产品时的清洁效果（见实验室清洁工艺开发）。这些实验可以用来测试推荐的清洁方法的有效性，以及新污物和已有污物清洁的相对难度。如果新污物比原最难清洁污物更容易清洁，可采用现有清洁程序对新物质进行清洁。如果该物质比原来污物都更难清洗，则可能需要对现有清洁工艺进行调整，并对清洁工艺进行验证。如果新污物比原污物更容易清洁，可基于风险评估确定效果确认的次数（如果有）。

Analytical Methods 分析方法

在清洁验证中选择一个合适的分析方法是非常必要的，该适当的分析方法应能够充分检测相关残留物。理解可以从分析结果中得出什么结论也很重要（例如检测的是产品还是清洁剂，结果是否合格？），检测结果决定了清洁方法是否可行或需要进一步改进。本章讨论的内容是怎样选择一个合适的测试方法，包括适用性、化学和微生物测试方法的信息，以及测试方法的验证。

本章的重点不是阐述分析方法的特性和局限性（尽管对此也有一定描述），而是判断获得了什么信息以及何时可采用某一特定分析方法的思考过程。对于清洁工艺的理解是在清洁验证不同阶段选择适当分析方法的关键。

 

Purposes of the Analytical Method分析方法的目的

在一个生命周期的清洁验证方法里，在清洁验证的不同的阶段可能使用不同的分析方法来评价残留物。清洁验证的生命周期包括设计/开发、确认和验证维护。在生命周期中的任一阶段，分析方法也可以作为调查的一部分。考虑和评估希望以及能够从一个特定分析程序中获得什么信息是很重要的。

 

例如，在早期的开发过程中，可能没有残留物的足够的信息（例如活性成分是否降解），而且一个特定的分析方法可能也没有经过验证。然而，在清洁工艺开发时，采用非专属性方法可能有助于较准确地了解清洁工艺的综合效果，即使这种非专属性方法可能是或不是最终清洁验证方案中选定的分析方法。

 

另外一个例子是用于调查的分析方法的选择。在验证（确认）中，通常首选的分析方法应能够适当检测出目标残留物（例如活性成分）是否符合预定的可接受限度。但是，对于一个偏差（不符合）的调查，在特定的条件下（例如在验证方案中使用的是一个非专属性方法），采用一个能够定性检测出该残留物性质（例如，是活性成分、清洁剂还是辅料？）的分析方法则是更为重要的。

 

需要重点强调的是，理解为何选择一个分析方法是建立一个可靠的、科学的和基于风险的清洁验证方法的关键。仅仅因为是过去使用过的分析方法并不一定意味着它可以用于新的应用中。

 

Practical Considerations in Selecting Analytical Methods选择分析方法的实际考虑

在理想的情况下，应选择最好的分析方法；实际上，分析方法的选择可能会受到实际情况的限制。许多情况下，更重要的不是选择的分析方法是最佳的，而是该方法能够满足预期的目的。在选择分析方法时，必须考虑一个特定公司现有的分析方法，例如，如果现有的分析方法能够满足检测目的，公司就不太可能再投入开发另一个新的分析方法。新的方法可能意味着设备采购、人员培训和设备维护投入，相关的费用需与预期的收益进行平衡。例如，直到TOC方法替代了药典方法中的易氧化物检验之后才被广泛应用于清洁验证中，之后制药公司也就很快地熟悉和接受了这项技术。

 

另一方面，如果现在的内控方法不足以满足预期的目的，则需要采用一个新的分析方法，这些工作可以在合同实验室完成或建立新的内控分析方法，可基于商业上的考虑决定建立新的内控分析方法还是由合同实验室完成。

 

Specific vs. Nonspecific Analytical Methods for ValidationProtocols验证方案中的专属性和非专属性方法对比

专属性分析方法是指那些在有预期干扰物存在的情况下仍可以检测特定残留物的方法。如果在验证方案中的目标分析物是活性成分，那些干扰物可能包括降解物和有关物质、辅料、清洁剂和清洁工艺副产物。专属性方法包括液相色谱法（包括HPLC、UPLC和TLC）和光谱法（包括紫外、可见和红外），这些方法都需要使用适宜的对照品。相反的，非专属性方法测量的是一种大致的性质，例如电导率和TOC，它可能源于多种分析物和不同来源。

 

分析方法的选择可能取决于清洁工艺后存在的残留物的性质。只有在清洁过程中活性成分没有发生降解（例如，在经过高温和极端的pH之后），使用一个专属性的方法测定该活性成分才有意义；如果已知在清洁工艺中活性成分会发生降解，那么使用专属性方法检测活性成分时，可能就不会检测（测量）到活性成分。在这种情况下，验证方案中就应该考虑使用一个专属性测定降解物或采用一个非专属性方法（例如TOC）测量残留；如果限度是按照活性成分的降解物建立的，也可以考虑采用一个专属性分析方法测定降解物。

 

应该认识到，在验证方案中，使用适宜的非专属性分析方法更能证明清洁方法的耐用性，因为除了目标残留物外其他成分也会有响应，而这种响应将被假设为源于目标残留物。然而，当检测结果超出限度时，使用一个非专属性分析方法无法为失败提供任何信息，偏高的检测结果可能来源于活性成分、辅料、清洁剂和/或这些成分共同作用造成的响应值。

本技术报告中的任何内容都不应理解为：一般应优先选择专属性方法而不是非专属性方法。

 

Regulatory Status of Specific and Nonspecific Methods专属性和非专属性方法的法规状况

无论是专属性方法还是非专属性方法，监管部门都是可以接受的。然而，必须要注意不要误用分析方法。例如，如果不知道清洁过程中活性会发生降解，就可能错误地使用专属性方法；如果非专属性响应不完全源自目标残留物，则可能误用非专属性的方法。

美国FDA清洁验证指南要求“对于检测残留或污染物的分析方法，应该验证其专属性和灵敏度”。因此有些人认为应使用专属性的分析方法，但更恰当的说法应该是，不管使用哪种类型的分析方法，要确保能够恰当地使用该方法。欧洲PIC/S建议“用于检测残留物或污染物的分析方法对于被分析物应该是专属的”。这再一次被解读为应该使用专属性的分析方法。但是实际并非如此，因为非专属性方法在世界上各公司已经广泛地应用并且被美国FDA和欧洲药监当局所接受。

 

Most Commonly Used Analytical Techniques最常用的分析技术

这一节中我们所要讨论的焦点是清洁验证中最常用的分析方法。专家组认为应基于清洁验证的各个阶段所提供的相关信息，选择常用的分析方法。方法的特性、优点和局限性经常因使用的条件而不同，因此本文不再赘述。

 

Additionalconsiderations in selecting methods are listed below:

选择方法还要考虑以下内容：

•Availability of instrumentation可用的仪器

•Speed of analysis检测的速度

•Specificity of technique检测技术的专属性

•Sampling limitations (including sampling solvents)取样限制（包括取样溶剂）

•Detection/quantitation limis检测限/定量限

•Linearity of response响应值的线性

•Online adaptability能否在线检测

•Cost费用

 

在制药清洁验证最多的应用是在一已验证范围内定量测定残留物的量。然而，在一些特定的情况下，合格-不合格检测，也被称为“放行-不放行”检测，也可用来检测残留物是否在可接受限度之下。这种检测可以用于临床生产的确认批（如果在线性范围内进行全面验证则成本可能较高）或用于例行监测和设备放行（基于最终淋洗液的检测结果）。合格-不合格检测通常不能证明清洁工艺的耐用性，除非合格-不合格点远远低于所需的可接受限度。由于该转换点是一个范围，因此这个范围必须是已知的，并在验证过程中建立该范围与限度之间的关系。实际的结果，尽管是合格的，可能与不合格结果是非常接近的，考虑到结果的正负误差，可能实际上就已经是不合格的结果了。

 

对于生物制药企业的分析方法的更多信息请参考PDA技术报告第49号，《生物技术清洁验证要点》。

 

Liquid Chromatography (LC)液相色谱法（LC）

液相色谱法包括HPLC（高效液相色谱）、UPLC（超高效液相色谱）和TLC（薄层色谱）。所有这些方法都是通过色谱方法先将各组分分离，再测定各分离组分的量。对于HPLC法和UPLC法，通常都是采用紫外（UV）检测器进行的测定，根据待测物也可以选择其他适宜的检测器。

HPLC法和UPLC法通常为专属性方法，被广泛应用于小分子生产（包括API和制剂）中活性成分的测定。多数情况下，HPLC法/UPLC法已经被开发成活性成分的含量测定方法，只需要做小的修改即可用于确认时残留物的测定。这些额外的修改包括确认线性范围是否适用于残留物的测定，以及在清洁系统中存在的“预期的干扰物”是否会干扰活性成分的测定。如果活性成分在清洁过程中发生降解，那么HPLC法/UPLC法可能就不适用于测定活性成分的残留，除非该色谱条件可以将降解物分离并测定出来。

 

TLC方法可以应用于小分子化合物清洁的各个阶段。例如，它可以用于设计/开发阶段以确认和定性活性成分的降解情况。TLC方法也可以用于调查（在清洁验证的各个阶段）以定性残留物。

 

UltraViolet/Visible Spectrophotometry (UV/Vis)紫外/可见分光光度法（UV/Vis）

紫外/可见分光光度法是通过在特定波长下测定残留物溶液的透过率/吸收值来进行测定的。它通常要求分子中存在一个生色基团，也可以通过衍生法使残留物产生一个生色基团。例如，紫外/可见分光光度法通常被小分子化合物生产企业特别是API生产企业所采用，它不需要将残留物分离出来进行定量。由于该方法比较简便，因此可以应用于清洁验证的设计/开发、确认和验证维护阶段，以及各种调查中。紫外/可见分光光度法在小分子API生产中也可以作为PAT技术判断清洁步骤的终点。

 

Total Organic Carbon (TOC)总有机碳（TOC）

TOC法可以用于含有大量有机碳的残留物的检测。TOC法是通过将样品中的碳氧化并测定所生产的二氧化碳的含量来完成的。氧化的方法包括紫外法、过硫酸法和燃烧法，检测产生的二氧化碳的技术包括电导率法、基于膜的电导率法和红外法。在线和离线的TOC都是可行的。

对于使用TOC法，目标残留物必须具有足够的水溶性。用于清洁验证的TOC法通常是将所有的检测到的残留物都假设成目标残留物。在生产过程中，如果目标残留物（例如活性成分）在清洁过程中会发生降解，则TOC法是常用的方法。然而，TOC法也可以用于那些活性分成不发生降解的情况，在这种情况下使用TOC法的理由是分析方法易于开发，而且在TOC检测中最差条件的假设是始终存在的。

TOC也可以用于清洁验证的各个阶段，包括设计/开发、确认和验证维护，以及调查。

 Conductivity电导率

电导率测定是通过测定水溶液样品中解离的离子物质来完成的。在确认方案中，电导率读数表示为微西门子/厘米（μS/cm）；用于清洁溶液的控制和监测时，电导率表示为毫西门子/厘米（mS/cm）。电导率法经常被应用于清洁剂残留（例如碱性或酸性试剂）的检测，以及在自动清洁工艺（例如CIP）中控制清洁剂的浓度。电导率的读数受样品温度的影响很大，样品温度的调整、自动温度补偿以及指定温度的电导率/浓度曲线可以用于测量结果的校正。

为了将电导率读数与清洁剂的浓度相关联，应建立特定温度下的稀释曲线（电导率对浓度），这可以通过测定特定温度下接近可接受标准的不同稀释浓度的电导率完成。

电导率是一种非专属性的方法，它在一定范围内与样品溶液的离子浓度线性相关。分析仪器耐用，而且接受过相应培训的人员可以在生产车间进行检测。该方法不会区分不同的离子，因此如同TOC一样，所有超过水的基准电导率的结果都是由于污染造成的（例如清洁剂）。

电导率通常说明了碱性或酸性清洁剂的存在，测量电导率是一种判定冲洗终点的好方法，因此对于清洁工艺的日常监控，测量电导率也是间接证明清洁效果的好方法。

电导也被用于测定离子型活性成分的残留，不管是单独以水为清洁剂，还是使用了离子型清洁剂，只是所有的电导率响应值都应作为活性成分的响应值（即使其中的一些响应值源自清洁剂）。

 

Organoleptic Evaluation 感观评价

“感观”评价包括目视和其他评价，例如嗅觉。目视检查通常在清洁验证的各个阶段都有使用，因为目视洁净是生产设备符合GMP的最低要求。目视检查是一种非专属性方法，除非做进一步分析，一般无法鉴定残留物的性质。

需要进行培训并建立一个详细的文件，确保不同人员的“目视清洁”是一致的。目检结果受距离、角度、光线、表面的性质，以及检查人的视力影响会有很大不同。使用光学设备例如镜子、远程光纤视镜或管道镜可有助于目视检查。

 

目视检查程序应当明确检查者怎样处理观察结果。目视检查可以发现四种不同类型结果：残留物、表面异常、异物和水。残留物是主要关注点，当评估清洁行程是否合格时，发现残留物就可能意味着目视检查结果的失败。如果可能的话，应收集样品残留做进一步检测，以协助调查可能的原因。通常，在清洁验证中出现表面异常和异物时，不认为目检结果不合格，但必须进行进一步调查和纠正。应记录表面异常情况，评估“是否适合使用”，并纠正发现的各种问题。红锈在目视检查中是一种最常见的表面异常，它往往被认为是一种预防性维护问题而不是清洁工艺问题。异物及其去除应被记录下来。同样，异物是怎么进入到设备当中也要进行调查。有时应区分无积水（“自排水设备”）和无可视水滴（“干燥设备”），特别是对于积水，应记录观察结果，调查原因，并说明其对目视检查以及贮存过程中的微生物增长的影响。

如果可能的话，所有的设备表面被应该进行目检。当无法或不宜拆卸设备时，或者对设备进行目检可能造成人员伤害（如，进入限制性空间）时，可能无法对安装在该设备上的管线和管道内部（尽管可以对出口处进行观察）进行目检。

应建立目检培训计划，检查人员应按照要求接受培训和/或进行资格确认。如果对于一些区域无法进行目检，则应确保他取样方法（例如冲洗取样）能够充分地检测出潜在的目标残留物。

 

作为一种感观方法，嗅觉检查通常只用于设备取样时有一种特殊气味，应对此进行调查。

 

Other Useful Analytical Techniques 其他有用的分析技术

以下其他技术可能用于清洁验证的不同阶段。

 

pH

pH是一种测量氢离子浓度的技术，它可以作为工艺监测手段，特殊是当设备贮存在防腐溶液中（通常为酸性或碱性）时。pH法也可以用于定性确认是否存在正确的清洁溶液。pH法也可以作为电导率测量的补充，然而在测量碱性或酸性清洁剂残留时，pH法不如比电导率法，因为pH值与氢离子浓度呈对数关系，而电导率与离子浓度是直接线性相关的。此外，也没有必要将电导率与pH值直接关联，特别是对于中性清洁剂。

 

InfraRed (IR) 红外光谱法（IR）

红外光谱法包括FTIR（傅立叶变换红外光谱法）和NIR（近红外光谱法）。当调查中需要对可能存在的有机残留进行鉴别时，这些技术最为有用。确认过程中，可采用FTIR联合光纤探头直接测定设备表面残留物的量。

 

Light Microscopy光学显微法

光学显微法包括扫描电镜法（SEM），它是一种可以鉴定设备表面污染物的方法。大多情况下，传统的光学显微法和SEM可以与其他分析技术联合使用，例如X-射线衍射、质谱和核磁共振（NMR）。单独的显微技术可以鉴定残留物的物理性质，但不能鉴定其化学结构，显微法的一个实际的应用是用于评估和鉴定一个新的或旧的设备中的未知污染物，这些技术对于在调查中评估残留物是特别有价值的。

 

Titrations滴定法

滴定法是另一种简单但经常被人忽视的方法，尽管其在适宜的清洁情况下它可以提供有价值的信息。滴定法可能是专属性（磷酸盐）或非专属性（例如，对于所有的阴离子表面活性剂）方法，本方法可能更多地用于确认过程中碱性或酸性清洁剂的检测。

 

Gravimetric Analysis 重量分析法

重量分析法可以用于设计/开发和确认中。它多应用于测定小分子API合成过程中的残留物，通过将大量冲洗溶剂或回流溶剂蒸干而测得。

Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA)酶联免疫分析法（ELISA）

酶联免疫分析法是一种抗原-抗体反应，使用特定的化合物测定残留物。酶联免疫分析法通常局限于生物技术和生物制品生产中，可以用于设计/开发阶段以确认活性成分的降解，以及任何调查中。

 

Capillary Zone Electrophoresis (CZE) 毛细管区带电泳（CZE）

毛细管区带电泳又被称为毛细管电泳，这项技术是依靠电场里的电荷和摩擦力将残留物进行分离的，通常采用荧光检测器进行检测。CZE主要被应用于生物技术工业中，在设计/开发及确认阶段检测活性成分及其降解物，以及用于调查。

 

Atomic Absorption (AA) and Inductively Coupled Plasma (ICP) 原子吸收法（AA）和电感耦合等离子体

这两种技术都可以用于溶液中的金属，这种金属可以是是处方中的一部分或未知残留物（例如疑似红锈）。

 

Ion Mobility Spectrometry (IMS) 离子迁移光谱（IMS）

这项技术是质谱的一种类型，它只提供被分析样本的飞行时间。由于其分析时间较短（几分钟）而被提倡，可以更多地用于日常监测和放行。 

Microbial Test Methods微生物检验方法

1993年美国FDA清洁验证指南中指出“通过充分地清洁和设备存放以控制生物负载，这对确保随后的灭菌和消毒程序达到必要的无菌保证水平是非常重要的”。PIC/S指南要求“清洁程序的验证内容应包括去除前一产品、清洁剂的残留所带来的污染，以及潜在微生物污染的控制”（22）。因此微生物残留的控制也是清洁验证的一个重要部分。微生物残留包括生物负载和内毒素。通常清洁验证方案中应包含生物负载取样和检测，除非有科学的和基于风险的书面理由表明不需要进行，这可能包括生产上的考虑，例如小分子API生产中所有使用溶剂的工艺、口服制剂生产中使用乙醇进行最终淋洗、清洁之后进行灭菌，和/或有证据表明类似的清洁工艺能够对微生物有充分的控制。

 

Endotoxin内毒素

通常如果下一个产品质量标准中有内毒素检查项的话，应在清洁验证中进行内毒素检测。内毒素分析方法通常是药典方法。验证方案中不进行内毒素检测需要科学的和基于风险的理由，这可包括生产上的考虑，例如小分子API生产中所有的使用溶剂的工艺，有经验证可以减少细菌内毒素的操作步骤，和/或有证据表明类似的清洁工艺能够充分控制内毒素。

 

Bioburden生物负载

生物负载的检测可以采用淋洗水取样、棉签擦试取样和接触碟取样。淋洗水取样后一般采用薄膜过滤法过滤，再将膜贴在适宜的琼脂培养基上，培养、计数。淋洗水取样检测生物负载的优点是它可以提供设备清洁状况的全景信息。淋洗水生物负载检测通常采用水系统微生物的检测中已确认的方法。淋洗水取样/薄膜过滤检测的最大缺点是没有一个普遍适用的可接受标准。例如，如果取100ml淋洗水用于检测，可接受标准为100CFU/ml，而通常可以计数的菌落数应不超过300，这就要求如果符合计数标准要求的话样品的可接受标准应为3CFU/ml。在大多数情况下这并不是问题，可以通过降低样品的取样体积（或稀释样品）来解决。也可以是采用涂布平板阀或倒平板法进行微生物检验。

还有两种可以直接测量表面上生物负载的方法是棉签擦试法和接触碟法。对于棉签擦试法，应将棉签上的菌释放出来，通过涂布法或倾注法进行计数。接触碟法则可直接培养并计数。接触碟法和棉签擦试法最大的问题是可能将产品接触表面与未知培养基或棉签中的缓冲溶液相接触，因此在生产前应确认培养基或缓冲溶液是否已清除。接触碟法的另一个问题是需要设备表面是平整的。

大多数公司生物负载检测，需要在适宜的培养基中培养并计数。这种方法的缺点是只能提供菌落数而不是单个细胞数量。由于可能会破坏细胞，取样和检验可能影响报告的计数结果。另外，虽然生物负载报告结果通常小于20CFU，但一般说来计数结果如果低于20CFU，则说明你建立的方法是不科学的。另外一种方法是使用快速仪器法检测微生物，PDA技术报告33《新微生物检验方法的评价、验证和执行》可以作为讨论该快速检验方法的参考。