基因疗法有可能成为下一次医学大革命之一。它不仅可以治疗，还可以治愈，许多使人衰弱的疾病。通过载体的选择，可以靶向不同的组织，使治疗具有高度特异性，几乎没有脱靶效应。从 2004 年开始，随着 1680 多项新药试验的进行，人们对基因治疗的兴趣日益浓厚。

用于靶向递送治疗性基因的最有希望的载体之一是腺相关病毒 (AAV)，因为它具有高度特异性的靶向性，且缺乏免疫反应。目前大多数基于 AAV 的疗法是针对患者人数较少的罕见疾病或需要低剂量的靶点。当前将基于 AAV 的疗法应用于更普遍的疾病或需要高剂量的疾病的障碍是有限的生产能力。AAV 载体的高效可放大生产平台将允许进行更大规模的试验，这将加速药物开发并为影响更大人群的疾病提供治疗选择。

基于瞬时转染的 AAV 生产方法需要编码病毒蛋白和 DNA 的质粒，这是载体组装所必需的。通常，编码 Rep 蛋白和衣壳蛋白的两个开放阅读框放置在同一质粒 (pRepCap) 上，而 AAV 复制所需的腺病毒基因放置在第二个质粒 (pHelper) 上；侧翼为反向末端重复序列的目的基因 (GOI) 位于第三个 (pGOI) 上。然而，有些设计可以减少质粒的数量。生产细胞贴壁或悬浮生长。贴壁细胞通常能够提供更高的细胞特异性AAV 产量。瞬时转染方法的流行是由于它促进了通用性生产和快速工艺开发。质粒在生产时转染，特定的血清型和 GOI 可以很容易地改变，只需对该过程进行微小的调整。这种通用性允许在不同血清型和GOI 的生产之间快速转换。

最广泛使用的转染剂是阳离子聚合物聚乙烯亚胺 (PEI)。带正电荷的 PEI 通过与带负电荷的质粒 DNA 形成复合物来促进转染；这个复合物被称为复合体（polyplex）。当添加到细胞中时，复合体被吸收，并且由于 PEI 的质子海绵效应通过内体逃逸，PEI-DNA 复合物在胞质溶胶中释放，在那里它可以被转运到细胞核中。已经表明，这些复合物的大小和性质对转染效率有很大影响，较小的复合物更容易被细胞吸收，但进入细胞核的机会较低，而较大的颗粒则吸收速度较慢，但在递送 DNA 有效载荷方面更有效。

根据特定的细胞系和转染条件，更大或更小的复合物将导致更有效的转染。因此，当生产方式发生变化或使用新的细胞系时，有必要重新优化瞬时转染条件。除了复合物的大小外，作用在细胞上的剪切力对转染的有效性也有影响。

已经有研究表明，剪切力会影响纳米颗粒的吸收，包括 PEI-DNA 复合物。在转染过程中，细胞膜的完整性受到损害，增加了它们对剪切损伤的敏感性，这意味着以前不影响细胞的条件在转染后可能会变得有害。

与单细胞悬浮系统相比，贴壁系统的细胞特异性产量和载体质量可提高达 15 倍。虽然研究已经表明 AAV 载体可以由悬浮细胞产生，其单位体积产量类似于基于贴壁细胞的工艺，但是，这通常只有在经过费时费力的优化后才能实现。2D生产系统，如滚瓶或 T 瓶，提供了AAV 的高特异性生产率，但其受到可放大性的限制，使得大规模生产不经济。解决方案是使用一个3D系统，该系统保持贴壁细胞的高细胞特异性生产率，但允许该工艺随体积而不是表面积放大。如果贴壁系统可以具有与悬浮平台相同的细胞密度，大约 2 x 10⁶ cells/mL，则单位体积产量将显著提高。因此，可以潜在地认为，基于微载体的瞬时转染工艺将悬浮培养的可放大性与贴壁生产的高特异性生产率相结合，这可能会产生极其有效的工艺。

自 1960 年代以来，微载体已被用于在悬浮系统中培养贴壁依赖性细胞。使用微载体的培养已成功用于规模超过 2,000 L的疫苗生产。因此，微载体提供了一种可能的解决方案，来突破依赖贴壁培养的AAV 生产的瓶颈。

虽然能够提供接近于悬浮的可放大性，但微载体有其自身的限制。其中之一是由于细胞对流体动力学环境的有效尺寸增加，细胞对剪切的敏感性增加。涡流是在湍流流体中形成的，这些涡流的大小与传递给流体的功率成正比。其中最小的涡流和输入到流体的功率与 Kolmogorov 涡流长度方程相关。当湍流中的涡流尺寸减小时，颗粒和涡流之间的尺寸变得相当，并且作用在颗粒表面上的剪切力增加。如果 Kolmogorov 涡流长度与微载体的大小相当，则表面会经历高剪切，从而损坏附着的细胞。

制备使用微载体的大体积培养物是生产的一个问题。为了增加贴壁细胞的数量，需要将附着在微载体上的细胞分离并重新接种到更大体积的大量微载体中。与悬浮细胞培养相比，这种分离和重新附着的过程会降低效率。

根据细胞系的不同，细胞的贴壁依赖性可以根据使用的培养基进行修饰。如果仅在培养的某个阶段（例如，在转染和 AAV 生产期间）需要贴壁依赖性，则在前一个阶段，即细胞扩增阶段，将细胞保持为悬浮状态，之后在生产阶段将培养转变为基于微载体的贴壁培养，将是一个非常有效且在经济性上具有吸引力的策略。这种系统非常适合大规模生产 AAV，因为它可以利用贴壁细胞提高的产品质量和产量，同时保持悬浮培养的效率和经济性来构建细胞量。

在本研究中，假设 HEK293T 细胞可以在悬浮液中生长，提供此类操作的简便性，然后将细胞贴壁在微载体上，以便在贴壁细胞中进行三质粒瞬时转染 AAV表达。后一种方法受益于更高的特异性 AAV 产量，因为通常报道贴壁细胞系统比悬浮细胞更高。考虑到这一过程是为了在生物反应器中放大商业化应用而开发的，因此研究了微载体上的培养物在搅拌罐容器中的剪切力带来的限制和连续转染的可行性。最后，本研究旨在提供基于微载体的工艺的概念验证，以便为商业化规模的 AAV 生产提供易于规模放大的解决方案。

详细实验操作步骤和结果讨论，请参考原文。

图5. DNA 浓度对 125 mL Bellco 转瓶中固定在 Cytodex 3 微载体上的 HEK293T 细胞转染的影响，通过 CHO 细胞的转导分析检测，使用从转瓶中不同时间收获的上清液样品进行测量，转染时的细胞密度为 1.4 × 10⁶ cell/mL；转瓶 1 和 2 的最终 DNA 浓度分别为5.72 μgDNA/mL 和 11.44 μgDNA/mL。(a) 在转染后选定点上清液样品中转导的 CHO 细胞的分数和 (b) 在两个转瓶中产生的转导单位总数.

图6. 转染125 mL Bellco 转瓶中固定在Cytodex 3 微载体上的HEK293T 细胞，转染后 114 h收获上清液样品，进行TCID50 分析。最终浓度分别为 (a) 5.72 μg DNA/mL 或 (b) 11.44 μg DNA/mL ，细胞密度为 1.4 x 10⁶ cells/mL，对应于图 5a 的转瓶 1 或 2；将上清液样品连续稀释并用于转导 CHO 细胞。转导细胞的数量随着上清液体积的增加而增加，直到达到用于转导的细胞数量，导致渐近行为。

图7. 根据 TCID50 分析确定的滴度所计算的转导单位总数，表示为转导 CHO 细胞总数的函数；模型 y = b x (a - x)^-1的近似值，系数 a = 128,900 和 b =107,100，由线性回归确定。

图9.在 DASBox 生物反应器中产生的总累积转导单元，工作体积150 mL，以灌流模式操作，并用 11.44 μgDNA/mL 转染，表明 AAV 生产直到最后第5天。

图10. 连续微载体接种系统的工艺流程图；D-001和D-002为10 mL罐；HV-001至HV-004为夹管阀；P-001和P-002为空气泵；S-001至S-004为0.2μm 除菌空气滤器；ATM指示为空气；DASBox生物反应器罐连接至“微载体”、“HEK293T细胞”和“接种的微载体”。

图11. 如图 10 所示，在连续微载体接种过程的静态混合器出口处拍摄的载有细胞的微载体的图像；比例尺代表 200 μm。

图12. 半连续转染工艺的流程框图。微载体和 HEK293T 细胞在相应的标签处进入工艺，在静态混合器中混合；之后，细胞附着在微载体上。接种后的微载体流入中间反应器，停留时间为一天。DNA 混合物和 PEI 在相应的标记处进入工艺，它们在复合物形成步骤中以给定的比例混合。然后用形成的复合物转染附着在微载体上的 HEK293T 细胞，然后将它们泵入生产反应器中。

讨论

基因治疗将彻底改变医学。在病毒载体的最前沿，AAV 是领先的候选者。目前 AAV 的障碍是更广泛的临床试验以及商业化供应所需的更高的生产能力。行业迫切需要一种灵活的生产工艺，可以生产不同规模的 AAV 载体，且理想的工艺需允许从载体筛选到大规模生产的轻松规模放大。贴壁转染除了是发现阶段的策略外，还提供高达悬浮细胞 15 倍的细胞特异性滴度。当前基于 2D 培养的方法受到 AAV 疗法从发现到商业化批准所需的可放大性的影响。微载体为这个问题提供了解决方案。使用微载体的工艺可以很容易地应用于现有的转染方案，无需修改，因此不需要大量优化工作。本文介绍的工作表明，使用 T 瓶的 2D 转染工艺可以成功地放大到 200 mL 生物反应器，有效表面积超过 1600 cm²。连续转染的概念验证证明是可能的，这将能够在不增加反应器占地面积的情况下提高基于微载体的系统的生产能力。

本系统是一个概念验证，表明可以连续转染附着在微载体上的细胞，这些细胞本身是通过连续微载体接种产生的。全自动转染工艺可以减少手动转染的可变性。通过更好的过程控制，DNA、PEI 的浓度，甚至复合物的大小，都可以动态改变，以形成最有效的转染。连续转染系统还可用于更好地了解某些培养基成分对 AAV 生产的影响，例如，通过比较两种不同培养基成分在稳态下的生产率，从而可以直接比较两种培养基。相反，在批次模式下，动态特性会扭曲某些成分的效果。此外，可能是大规模条件下规模放大最重要的问题，真正均一的批次转染是不可能的，因为均质化不可能瞬间发生。产生窄分布的 PEI-DNA 混合时间和复合体大小的唯一方法是使用连续转染。

观察以批次模式进行的 2,000 L 反应器规模的放大过程，需要转移的 PEI-DNA 复合液体积至少为 500 L。在一分钟内转移整个复合体体积需要从靠近培养生物反应器的至少 500 L 的混合罐中抽出 30 m³/h 的泵流量。重要的是，在500 L 大小的罐中混合可能不是均匀分布的，存在混合度低的区域，例如靠近叶轮轴、罐壁以及底部和液体表面。DNA和 PEI 是大分子，扩散系数非常低，这意味着混合主要发生在靠近叶轮的强烈混合区。在批次混合和操作中，这种局部混合增加了复合物必须与彼此和新的 PEI 或 DNA 分子反应的时间量的大量异质性，从而导致复合物大小的宽泛分布。

如本文所示，该工艺可以改为以连续模式进行。当所涉及的液体体积流速大于μL/min 时，该过程可以转变为完全连续的，这为细胞提供了更容易的操作和最有可能更可控的转染条件。在大规模条件下，均质单批转染会导致非常大的不确定性，而获得窄分布的 PEI:DNA 复合时间的唯一方法是使用连续转染。此外，无论需要多少，这里获得的连续接种微载体流也可以规模放大，实现细胞在微载体上高度均匀的分布。

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原文：B.Ladd, K.Bowes, M.Lundgren, et al., Proof-of-Concept of Continuous Transfection for Adeno-Associated Virus Production in Microcarrier-Based Culture. Processes, 2022, 10, 515.