CAR-T细胞制备流程包括以下几个步骤：
抽取血样，白细胞分离；
在GMP环境下，准备CAR基因，进行CAR基因转导，获取CAR-T细胞
CAR-T细胞扩增，纯化，并进行质量控制检查；
运送回治疗机构，病人先进行淋巴细胞清除化疗，再输注CAR-T；
CAR-T细胞识别并杀伤癌细胞。
CAR-T治疗流程图 [5]（原始图来自于NCI-NIH）
CAR-T细胞治疗，彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗结果。CD19 CAR-T临床适应症主要为难治性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病等，BCMA CAR-T则针对多发性骨髓瘤。
CAR-T总体反应率在52-85%，完全应答率达到33-59%[5-7],优于单克隆抗体药物（如Tafasitamab）、小分子抑制剂（如Selinexor）、ADC药物（如Polatuzumab vedotin）等。
FDA新批准大B细胞淋巴瘤治疗药物（Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 8553）
目前FDA已经批准了六款CAR-T细胞治疗产品，具体数据参考下表。
针对实体瘤（如肝细胞癌、胃癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌等），目前虽然进行了数百项CAR-T临床研究，比如Mesothelin（29项），HER2和GD（各26项），GPC3（23项）CEA和CLDN18.2（各10项），除去CLDN18.2（科济CT041）取得ORR 48%的疗效，其余靶点大多无应答（如下表）。
目前CAR-T细胞治疗依然采用个体化生产，产能有限、生产周期长，且成本高昂，影响患者可及性。
收费高昂，超出了大多数患者的支付能力；
病人分离的白细胞质量可能达不到CAR-T生产的标准；
-
CAR-T生产周期长，病人疾病进展可能较快，无法及时获得CAR-T细胞疗法。
CAR-T作为免疫治疗产品，存在免疫相关一些副作用，包括细胞因子风暴（CRS）和神经毒性等，如上表统计CRS发生率达到80-90%，神经毒性发生率达到18-64%[5-7]。此外，脱靶毒性等也是不能忽略的问题。
部分肿瘤细胞对于CAR-T治疗不敏感，无法产生消退。
长时间看，细胞治疗产生消退的患者，如多发性骨髓瘤50%以上会复发（无进展生存期小于12个月）[7]。产生的机制多样，比如肿瘤细胞通过突变靶抗原，对CAR-T细胞治疗产生获得性耐药。比如2021年在Abecma（idecabtagene vicleucel; ide-cel）获批后不久，BMS、蓝鸟和丹娜法伯癌症研究院（Dana Farber Cancer Institute）联合在Nature communications发表文章[9]，阐述了BCMA CAR-T一种耐药机制: 即BCMA双等位基因丢失。
如在适应症和临床现状中讨论，目前CAR-T治疗实体瘤，应答率和有效率都极低，可以概括为基本无效。非常多的文章讨论过相关机制，比如缺乏特异性肿瘤相关抗原，物理屏障阻隔CAR-T穿透入实体瘤内部，恶劣的肿瘤微环境诱导CAR-T功能耗竭等。
除了以上挑战之外，CAR-T细胞的质量控制，临床前试验模型的缺乏等也是研发和临床申报中广泛面临的问题。(
更多内容参见文末
)
如五大挑战部分所阐述，目前获批上市CAR-T均是个体化治疗产品，而个体化方案是限制可及性的主要因素。很多企业正在寻求现货型（off-the-shelf）CAR-T来解决这一难题，在目前来看这是有效的突破方向。
现货型CAR-T的优势：
可提前制备，直接使用；
可批量生产，降低成本；
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宿主同种异体T细胞识别未修饰T细胞上不匹配的人类白细胞抗原(HLAs)，引起排斥反应。一些宿主NK细胞也可能感觉到不匹配的T细胞上某些宿主HLAI类分子的缺乏，促进排斥。现货型CAR-T通过主要开发逻辑是阻断移植排斥反应。常用的策略包括：
敲除引起移植排斥反应的HLA分子；过表达HLA-E/G或CD47；在现货型CAR-T细胞上保留HLA-C和非经典的HLAI类分子；主动的方法可以通过非选择性抑制宿主免疫(清除宿主淋巴细胞，包括CD52/CD38单克隆抗体和FOLFOX)；选择性消除激活的同种异体反应性淋巴细胞。
但现货型CAR-T，基因敲除可能会引起T细胞染色体异常[12]，存在安全性问题，该技术的先驱Cellectis和Allogene多次被叫停临床研究。
CAR基因工程策略 [13]
现在的策略包括，改变scFv的亲和力，自杀开关，逻辑开关（减少off-target），适配体CARs（减少off-target），小分子调节CARs（小分子作为调节开关等）。
现在的策略包括，敲除免疫检查点分子；利用抑制转激活受体，将抑制信号转为激活信号；表达存活基因；武装分泌PD-1抗体基因。
基因工程增加共刺激分子；增加细胞因子分泌（IL-7，IL-12等）；增加细胞因子受体表达等。
武装CAR分泌IL-12等细胞因子；表达截断的TGF-β受体；溶瘤病毒增加靶抗原；将抑制信号转为激活信号的受体。
多特异性CAR有助于解决肿瘤细胞获得性耐药的问题。
比如增加特异性趋化因子受体的表达，武装多个识别肿瘤及细胞外机制等的scFv等，增加CAR-T向实体瘤局部迁移。
除了CAR-T之外，使用CAR武装另外一个免疫效应细胞（NK细胞）也成为研究热点。CAR-NK有多种优势，比如对移植排斥反应天然抵抗，可以使用脐带血干细胞分化产生NK细胞，因而天然具有现货型CAR细胞的特征；体内半衰期短，可以降低毒副作用的考量。不过，现在只有30多个临床开展，还没有获得令人振奋的临床结果，开发尚需时间。
CAR-M巨噬细胞是抗原递呈细胞，CAR-M增加抗原递呈能力，激活体内的T细胞，从而发挥抗肿瘤活性。但其临床有效性也同样需要时间来检验。
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CAR-T在血液肿瘤惊艳的表现，让CAR-T无疑成为人类攻克癌症的重要武器。
针对CMC研发生产的诸多困境，学术界和产业界同样尝试了不同的策略，在通过现货型CAR-T降低成本，增加可及性，通过基因工程改造CAR增加实体瘤穿透性的尝试中，Eppendorf 将与您携手共同探索发展与未来。
1.https://s21.q4cdn.com/104148044/files/doc_financials/quarterly_reports/2022/BMY-Q22022-Earnings-Press-Release.pdf
2.https://www.novartis.com/sites/novartis_com/files/q2-2022-media-release-en.pdf
3.https://s29.q4cdn.com/585078350/files/doc_financials/2022/q2/Gilead-Sciences-Q222-Earnings-Press-Release-2-August-2022.pdf
4.https://www1.hkexnews.hk/listedco/listconews/sehk/2022/0721/2022072101231_c.pdf
5.Crees, Z.D.; Ghobadi, A. Cellular Therapy Updates in B-Cell Lymphoma: The State of the CAR-T. Cancers 2021, 13, 5181
6.Nikhil C. Munshi et al, Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma, N Engl J Med . 2021 Feb 25;384(8):705-716.
7.Jesus G Berdeja et al，Ciltacabtagene autoleucel, a B-cell maturation antigen directed chimeric antigen receptor T-cell therapy in patients with relapsed or refractory multiple myeloma (CARTITUDE-1): a phase 1b/2 open-label study，Lancet 2021; 398: 314–24
8.Victor Moreno et al，Adoptive cell therapy for solid tumors: Chimeric antigen receptor T cells and beyond，Current Opinion in Pharmacology 2021, 59:70–84
9.Mehmet Kemal Samur et al，Biallelic loss of BCMA as a resistance mechanism to CAR T cell therapy in a patient with multiple myeloma，NATURE COMMUNICATIONS | (2021) 12:868 | https://doi.org/10.1038/s41467-021-21177-5
10.Xu X, Huang S, Xiao X, Sun Q, Liang X, Chen S, Zhao Z, Huo Z, Tu S and Li Y (2021) Challenges and Clinical Strategies of CAR T-Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia: Overview and Developments. Front. Immunol. 11:569117
11.Feiyan Mo et al, Taking T-Cell Oncotherapy Off-the-Shelf, Trends Immunol. 2021 Mar;42(3):261-272.
12.Nahmad, A.D., Reuveni, E., Goldschmidt, E. et al. Frequent aneuploidy in primary human T cells after CRISPR–Cas9 cleavage. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01377-0
13.Evan W Weber et al, The Emerging Landscape of Immune Cell Therapies, Cell. 2020 Apr 2;181(1):46-62.
14.Larson RC, Maus MV.Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells, Nat Rev Cancer . 2021 Mar;21(3):145-161.
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