将抗体的特异性与药物的毒性结合并创造出一种具有更高层次的靶向药物的概念可以追溯到1913年，当时Paul Ehrlich提议开发一种 "神奇的子弹"，用于选择性地靶向治疗肿瘤。尽管这一概念简单而新颖，但是第一个ADC直到2000年才被用于临床，FDA批准了Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg, Pfizer/Wyeth）用于治疗急性骨髓性白血病。2011年，Brentuximab vedotin (Adcetris, Seattle Genetics)被批准用于治疗无细胞白血病。两年后，Trastuzumabemtansine (Kadcyla, Genentech/Roche) 被批准用于治疗晚期人类表皮生长因子2（HER2）阳性乳腺癌。到目前为止，已经有14种ADC被批，包括Inotuzumab ozogamicin; Polatuzumabvedotin; Enfortumab vedotin; Trastuzumab deruxtecan;Sacituzumab govitecan; Belantamab mafodotin; Moxetumomabpasudotox；以及Loncastuximab tesirine等

第一个系统性的证明定点偶联药物具有较好的疗效是来自于Genentech的Junutula及其同事，其利用了一种名为THIOMAB的定点偶联技术。该技术中主要是引入了一个额外的半光氨酸，在还原性条件下，引入的半胱氨酸及链间的二硫键被还原，在CuSO4的作用下氧化并再次形成二硫键，而药物最终通过马来酰亚胺化学反应偶联到额外引入的半胱氨酸上。与第一代偶联药物DAR值平均为３相比，THIOMAB的定点偶联技术ADC药物的DAR值为２。研究者利用该技术将MMAE和抗MUC16的抗体偶联，并在卵巢癌动物模型中取得了更好的疗效。更重要的是，该药物在提升疗效的同时具有更高的剂量耐受性并提高了药物在大鼠和猴血清中的稳定性。

由于ADC市场的增长及定点偶联技术的优势，越来越多的研究者致力于利用第二代抗体偶联技术开发ADC药物。一般来说，第二代抗体抗体偶联技术需要将一个含有反应性基团独特的位点特异性引入到抗体中，然后使用生物正交反应选择性地将一个功能分子与这个独特的基团进行选择性偶联。目前，遗传密码扩展、蛋白质标签和酶处理都被用于将独特的反应性基团定点引入蛋白质。在原核细胞和真核细胞中 ，将非经典氨基酸（ncAAs）引入蛋白质的策略，为定点偶联技术提供了 一个比较简便的方法。一种具有生物正交性的ncAA--对乙酰苯丙氨酸（pAcF）首先被用来探索定点偶联。研究者使用一个酰胺-tRNA合成对(aaRS)/tRNA，与宿主的内源性翻译机器正交，并将pAcF定点插入到曲妥珠单抗的琥珀密码子所代表的位置。利用该方法，研究者得到了含有双pAcF的曲妥珠单抗（每个重链上都含有一个）。然后将其与烷氧基胺衍生化的药物单甲基奥司他丁偶联并最终得到了DAR值为2的ADC药物，该药物展现了与一代ADC药物相同的疗效，而且其安全性有了一定程度的提高。

‍利用酶促反应共价键偶联的方式，有研究者利用谷氨酰胺转移酶和分选酶（sortase）进行抗体的定点偶联。谷氨酰胺转移酶可以催化谷氨酰胺和伯胺形成酰胺键。Schibli团队是第一个利用细菌的谷氨酰胺转移酶进行定点偶联的，但是其研究发现，尽管抗体中有大量谷氨酰胺存在，酶促反应只有在切除N297位点的糖或者进行N297S突变后，才可以在抗体的Gln295进行酶促反应。而其它一些研究者引入含有谷氨酰胺的短肽标签LLQGA，在谷氨酰胺转移酶的催化下可以形成DAR值为1.8-1.9的ADC药物。

利用相似的方式，分选酶（sortase）也可以对特定的氨基酸序列进行催化反应，其可以将聚甘氨酸和LPXTG短肽标签进行催化连接，因此抗体可以通过基因工程引入LPXTG短肽标签并进行定点偶联。

除了利用酶促反应，有研究通过引入特定的氨基酸序列到抗体重链的末端如FCPF，这四个氨基酸含有“π-钳”可以提供一个特殊的环境并有利于其中半胱氨酸的定点修饰（对于含有“π-钳”序列的肽来说，当其一部分的“π-钳”产生了gly突变后再在存在竞争的条件下进行反应时，会只选择那些含有“π-钳”序列的肽进行定量的反应）。

小结：总的来说，第二代定点偶联技术是通过引入生物正交分子到抗体中，然后利用引进的特殊位点进行定点偶联，但是这些特殊位点的引进往往需要对抗体进行改造，这可能会改变抗体的部分性质，甚至会改变抗体的折叠或者稳定性，因此会给后续的生成研究带来一定的挑战。

第二代抗体偶联技术虽然可以实现对抗体进行定点偶联，但是需要对抗体进行特殊改造，这在一定程度上可能会给ADC药物的开发带来一些新的挑战，因此有研究者开始考虑在不改变抗体完整的基础上，对天然的抗体进行位点特异性偶联。第三代偶联技术主要是聚焦于选择独特的氨基酸位点并利用独特的分子或者通过临近效应进行定点偶联，其主要分为以下4种：1）链间二硫键改造；2）糖基修饰；3）化学选择性的修饰；4）基于临近效应的修饰。

利用半胱氨酸将载荷偶联到抗体上，需要抗体中还原的巯基和载荷中硫醇特异性亲电子体之间发生反应。与其它基于赖氨酸残基偶联方法相比，该方法更具有一定的优势，因为抗体中半胱氨酸较少，可以使得偶联具有较高的特异性。链间的4对二硫键可以被还原成8个自由的硫醇，所以可以得到DAR值最高位8的均一ADC。二硫键再连接技术于1990年被Smith and Lawton研究团队开发，该方法可以在不影响抗体天然结构的前提下进行定点偶联。其主要分为以下4个步骤：（1）还原二硫键并得到两个具有活性的半胱氨酸；（2）载荷中的再连接试剂和其中一个半胱氨酸发生反应；（3）剩余的一个半胱氨酸和上一步生成的半胱氨酸-再连接试剂复合物发生反应，从而生成新的连接。

对于双砜试剂，其首先需要通过去除一个亚磺酸盐再活化，活化后得到单砜并和抗体中的一个硫醇反应形成二硫键，剩下的一个亚磺酸盐被去除得到Michael受体并与抗体中剩余的一个硫醇反应，从而将抗体中的二硫键链间。2014年Badescu等人利用该方式与Trastuzumab抗体偶联，得到了含有MMAE的ADC药物，其DAR值为4，且在10 mM DTT还原环境中也有较高的稳定性（上图a1）后续，有研究者利用双砜试剂烷基化的中间体烯丙基砜进行偶联，该试剂因为具有较高的水溶性，因此具有更高的反应效率（上图a2）

3,4-二取代马来酰亚胺偶联是在第二代马来酰亚胺试剂（NGMs）如3,4-二卤代马来酰亚胺和二硫代马来酰亚胺等进行的偶联。单/双砜类试剂偶联相比，反应PH比较宽泛（6.2-8），并且其反应速度快，可以有效减少抗体在反应中聚集的问题（下图b）.另外，其DAR值可以通过控制反应试剂的剂量和反应时间，实现0-4不同的DAR值

与3,4-二取代马来酰亚胺反应机制类似，有研究者利用二溴哒嗪二酮进行偶联。二溴哒嗪二酮型杂环中的两个N原子给偶联反应提供了可能，在该反应中，研究者实现了一步偶联，从而减少了偶联中相关试剂对抗体的影响（上图c）

2019年Walsh等人利用含有两个Michael 受体的二乙烯基嘧啶与还原后的二硫键反应，并且具有较高的偶联得率。但是因为该试剂中桥接二硫键的链较长（中间跨越7个碳原子），因此反应中存在二硫化物加扰。

小结：目前已经有很多研究用单/双砜，NGM，二乙烯基嘧啶等试剂与天然抗体的二硫键进行特异性偶联，但是目前还存在很多限制和陷阱。首先，偶联过程中二硫化物的加扰不可避免，这在一定程度影响产品的功效、产量和放大生产。虽然已经有一些方法用于改善该问题，如精确的控制反应条件，增加桥接的动力学，使用TECP连接的苯硫酚衍生物进行一体化反应等，但是这些根据不同药物的具体情况进行优化。其次，在还原条件下，这些桥接试剂无法区分还原的二硫化物和有利的硫醇，这在一定限制了二硫化物桥接缺乏没有游离半胱氨酸的抗体。Wilson 等人报道了一种三价砷(As(III)) 酸衍生物作为生成的潜在解决方案。

IgG型抗体中存在两个保守的糖基化位点N297，该位点位于CH2结构域，远离抗体结合抗原的功能结构域，因此利用该位点进行偶联不会对抗体的结合功能造成影响。总的来说，利用该糖位点的偶联，主要是通过在糖基上引入一个新的反应基团，然后再利用相关试剂进行定点偶联。

氧化裂解位于末端的顺式二醇组寡糖会产生一个醛基，一些含有氨氧基、肼或酰肼官能团的试剂可以与其发生化学反应，利用该反应可以将载荷定点偶联到抗体上。O'Shannessy 及其同事首先使用高碘酸盐氧化抗体的糖基形成醛基，然后与酰肼标记的生物素反应。类似的方法用于偶联多种分子，包括放射性标记的有机金属络合物、毒素和蛋白质/抗体。 虽然这些方法确实实现了天然抗体的位点特异性偶联，但是抗体糖基化的异质性极大地限制了该方法的适用性。此外，高浓度的高碘酸盐（10-30 mM）会导致敏感的蛋氨酸残基被氧化，可能会损害抗体的血清半衰期、完整性和功效。

为了完全避免高碘酸盐处理，一些研究小组通过引入具有生物正交基团的糖残基对寡糖进行了酶促修饰。博格曼等人研究表明使用 β1,4-半乳糖基转移酶突变体 GalT (Y289L) 可以将将C2 位置含有酮手柄的半乳糖掺入抗体寡糖中。然后可以在酮手柄和含氨氧基的衍生物（生物素或荧光染料）之间发生选择性结合。然而，该过程的转化率和效率需要进一步提高。Zeglis等人应用酶介导的糖工程和菌株促进的叠氮化物-炔烃环加成反应对PSMA抗体 J591的修饰寡糖进行位点特异性放射性标记（下图）。他们使用了β1,4 -半乳糖苷酶去除末端半乳糖，然后使用GalT（Y289L）引入叠氮修饰的半乳糖作为糖基的末端残基。然后使用含有去铁胺 (DFO) 的螯合剂并使用菌株促进的叠氮化物-炔烃环加成反应连接到抗体上。最后，可以通过将螯合剂修饰的抗体与 89Zr 混合来生成 89Zr 标记的 ADC。通过这种方法产生的 89Zr 标记的抗体被肿瘤选择性吸收，并在表达 PSMA 的前列腺肿瘤的小鼠模型中表现出优异的抗肿瘤活性。

作为一种替代策略，Li 和同事使用 Gal T 重塑抗体糖基，将现有的糖型转化为 G2 糖型（图 E）。然后将在C9位置带有叠氮化物的唾液酸衍生物掺入 N-聚糖使用唾液酸转移酶 ST6GalI。随后，二苄基环辛醇 (DIBO) 修饰的生物素、荧光团或细胞毒性药物与含叠氮化物的抗体反应，形成 DAR 为 3.5-4.5 的抗体偶联物。这种糖基化重塑策略为制备具有未改变的 FcγRIIIa 结合的同源 ADC 提供了一种有吸引力的替代方案。出于药代动力学原因，为了达到较低的 DAR，van Delft 及其同事报告了一种新的化学酶偶联策略，用于生成 DAR 为 2 的 ADC（图F)。去糖基化并分别通过内切糖苷酶 Endo S2 和半乳糖基转移酶 GalT (Y289L) 引入 GalNAz 后，修饰的抗体可以通过无铜点击化学连接到有效负载上，从而产生高度稳定和均质的 ADC，其 DAR值约为 2 。

除了在体外使用酶学和化学策略对抗体寡糖进行工程改造外，还可以通过使用寡糖残基的代谢工程引入含有生物正交反应基团的糖类似物来获得 ADC。Okeley 及其同事首次报道了使用岩藻糖基转移酶VIII在N-聚糖末端的岩藻糖类似物 6-硫代岩藻糖（下图）。具体来说，从在大约 200 种合成岩藻糖类似物中筛选的6-硫代岩藻糖过乙酸盐，可以以 60-70% 的效率替代抗体寡糖中的岩藻糖。随后，6-硫代岩藻糖部分通过马来酰亚胺与 MMAE 结合，产生平均 DAR 为 1.3 的ADC。与通过链间二硫键/马来酰亚胺偶联化学制备的 ADC 相比，使用该策略获得的 ADC 保持了改善的血浆稳定性和体外抗肿瘤活性。

小结：尽管在获得具有生物正交基团的糖型的 IgG方面取得了重大进展，但大多数酶介导的糖基化工程技术仍处于实验室规模的探索阶段。此外，为了产生 ADC，总是需要将一些非天然成分引入抗体聚糖中。据报道，一些经过细微修饰的聚糖在人体中具有免疫原性。因此，聚糖工程抗体偶联物的体内稳定性和免疫原性仍有待充分评估。

从概念上讲，进行基于化学选择性直接修饰特定氨基酸残基的化学反应是修饰天然抗体的最直接方法。然而，不同亲核氨基酸反应性的微小差异使得难以实现所需的化学修饰特异性。此外，由于结构相似的抗体之间存在残基异质性，化学和区域选择性修饰方法通常仅在特定情况下有效，限制了该方法的通用性。目前一个被广泛使用的概念即通过精确控制反应 pH 值来靶向具有最低 pKa 的赖氨酸，例如，N末端胺的碱性比其他赖氨酸弱因此其可以在pH 7.7 ±0.5条件下被靶向反应。下面总结了基于化学选择性的位点特异性抗体修饰的最新发展。

2007 年，Scheck 等人报道了使用 pyridoxal-5'-phosphate（PLP，维生素 B6）通过氨基转移反应将免疫球蛋白轻链的 N 端胺转化为酮。然后可以很容易地通过肟连接对酮进行功能化。与赖氨酸残基的其他侧链相比，碱性N-末端胺（亚胺形成）和更酸性的N-末端α-质子（互变异构）是N-末端胺化学选择性的基础。在升高的温度 (50℃) 下实现中等转化率 (47%)。基于相同的转氨机制，Witus 等人。利用 Rapoport 盐 (RS) 选择性地将免疫球蛋白重链的 N 端胺转化为酮部分，在温和得多的条件下（37℃），产率提高到67%（下图）。这些氨基转移试剂表现出一些残留偏好，如在鼠 IgG 中，PLP更喜欢轻链天冬氨酸而不是重链谷氨酰胺，而 RS 在人IgG中更偏向重链谷氨酸而不是轻链天冬氨酸。进一步的实验表明，PLP和RS的最佳反应伙伴分别是三肽 H-Ala-Lys-Thr 和 H-Glu-Glu-Ser。由于这些 N 末端序列不存在于天然抗体中，因此需要基因工程来获得最佳反应性。

基于控制反应动力学、蛋白质位点特异性或靶向高反应性赖氨酸的若干尝试已用于选择性修饰某些抗体赖氨酸残基。然而，由于赖氨酸选择性的机制尚不清楚，这些方法未能实现高产率。因此，很难将它们应用于抗体或其他蛋白质的修饰。为了解决这个问题，Matos等人报道了使用基于丙烯酸磺酰酯的试剂，结合pH控制，实现了对具有最低 pKa 的单一赖氨酸的选择性和高产率 (>95%) 的修饰（下图）。磺酰基氧通过椅子状过渡态加成到双键稳定了胺产生的正电荷。极性较小的半胱氨酸 S-H基团减少了氢键相互作用，从而解释了赖氨酸对半胱氨酸的化学选择性。区域选择性主要基于pKa控制，因为具有最低 pKa的赖氨酸最有可能在中性至微碱性条件下具有反应性。用丙烯酸酯修饰的赖氨酸残基可以通过氮杂-迈克尔加成进一步与含胺化合物结合。这种修饰策略的普遍性已用五种模型蛋白成功证明，包括人源化全长曲妥珠单抗抗体。流式实验证明，用抗癌药物克唑替尼进行位点特异性修饰后，曲妥珠单抗对人 HER2 的结合亲和力和特异性不受影响。但是，如果修饰的赖氨酸对抗体功能至关重要，那么偶联可能会失败。

Adusumalli 等人开发了另一种基于反应性的方法，称为关键定向修饰 (LDM)。LDM利用快速且可逆的胺反应基团来引导环氧基团和蛋白质组氨酸残基之间缓慢的不可逆反应（下图）。虽然对羟基苯甲醛与赖氨酸残基建立了快速的开关平衡，但连接的环氧化物部分只会与位于赖氨酸残基一定距离内的组氨酸反应。在组氨酸和环氧化物之间发生不可逆连接后，游离醛可以进行肟连接以偶联其他感兴趣的分子。两种 ADC，曲妥珠单抗-多柔比星和曲妥珠单抗-emtansine，已使用该技术制成，并且在体外具有抗肿瘤活性。为了扩大 LDM 的底物范围，Adusumalli等人报道了另一种用于修饰赖氨酸而不是组氨酸的 LDM 试剂。将中等离去基团从环氧化物转换为 2,6-dibromo-4-(morpholine-4-羰基）苯酚酯，为优化底物提供了更多选择。

小结：基于化学选择性的直接抗体标记是最方便的抗体修饰策略。在初始反应中只需要一种试剂来引入生物正交手柄，然后即可将载荷连接到抗体上。修饰的特定位点由抗体的内在特性和3D结构决定。在某些情况下，这种从抗体到抗体的变异性可能会导致产量降低或抗体功能受损。

另一种用于实现对天然抗体分子进行位点特异性偶联的新兴策略是利用邻近效应将交联反应物或催化剂引导至所需氨基酸残基。目前已经有研究者利进行选择性共价键的反应。

由于光交联在不同化学环境中的多功能性，光交联被用于对天然抗体进行位点特异性标记。苯甲酰苯丙氨酸 (Bpa） 是一种紫外线诱导的交联氨基酸，已广泛用于绘制蛋白质相互作用的图谱。在紫外线照射下（<365 nm），目标蛋白质中的 Bpa 会产生自由基，这些自由基会非特异性地插入附近的 C-H 键中，从而在蛋白质与其结合伴侣之间形成共价键。由于其化学稳定性和有效的紫外线诱导交叉性，Bpa 不仅可用于揭示有关分子相互作用的有价值信息，还可用于设计基于共价蛋白的激动剂、拮抗剂和抑制剂。Jung 及其同事使用半胱氨酸工程和马来酰亚胺化学构建了具有二苯甲酮衍生物的抗体结合肽（图 5A），这是使用该方法对天然抗体进行位点特异性标记的第一次尝试。具体而言，结合Fc的多肽中的氨基酸残基首先突变为半胱氨酸，然后与马来酰亚胺官能化的二苯甲酮反应。所得亲和肽能够将含二苯甲酮的交联剂引导至抗体Fc结构域。在紫外线照射后，二苯甲酮交联剂与抗体 Fc 结构域形成共价键，从而产生位点特异性偶联物。在最佳条件下（365 nm 紫外线照射 1 小时），大约 50% 的抗体群被一种或两种亲和肽共价标记。之后有研究使用不同类型的抗体结合肽来制备位点特异性标记的天然抗体，这些亲和肽包括蛋白 A 的衍生物（与抗体 Fc 结构域结合）、蛋白G的衍生物（与抗体 Fab 结构域结合）和通过噬菌体展示进化的FcIII抗体结合肽。Park等人首先通过利用FcIII将工程化的假单胞菌外毒素 A (PE24) 与曲妥珠单抗的 Fc结构域偶联，所得偶联物的细胞毒性显高于未经修饰的曲妥珠单抗，证明了该技术的生物医学应用。在另一个实施例中，首先将具有游离硫醇残基且含有Bpa的FcIII 肽与曲妥珠单抗偶联以引入独特的硫醇基团，随后与马来酰亚胺官能化 MMAE 偶联，偶联产物的DAR值为 1.9。虽然目前光交联反应的效率已经有大幅度提升，但是其交叉的化学选择性会使反应倾向于产生异质产物。此外，已知 30-60 分钟的紫外线照射会导致蛋白质损伤，从而可能削弱抗体效力。

虽然大多数基于肽的抗体偶联策略依赖于将紫外线敏感的光交联剂选择性递送至抗体中的特定位点，但可以通过递送能够基于邻近的反应性与亲核残基形成共价的亲电试剂如特定的赖氨酸，从而避免对紫外线的需求，该策略为邻近诱导抗体偶联技术(pClick)提供了基础。pClick作为对天然抗体进行位点特异性修饰的通用方法（图 5B）。具体而言，赖氨酸邻近探针4-氟苯基氨基甲酸酯赖氨酸 (FPheK)，其能够与近端抗体赖氨酸残基共价连接并被引入与抗体Fc区结合的亲和肽（FB）的Glu25位置。在与抗体结合后，FPheK修饰的FB肽通过 FPheK 自发交联到特定的赖氨酸残基，共价连接到抗体上。该方法在不同IgG亚型实现了 91-99% 的偶联效率，而且不会产生任何可检测的非特异性偶联产物。在另一项研究中，FB 肽可以进一步缩短至33个残基，而不会影响其结合亲和力和偶联效率。这种化学合成的 FB肽用于合成ADC和双特异性小分子抗体偶联物，并具有较好的抗肿瘤活性。此外，该策略最近被用于制备第一个骨靶向抗体，该抗体能够增强对骨的生物分布，并显著提高小鼠模型中对 HER2+ 乳腺癌骨转移的治疗效果。

作为使用邻近定向反应物对天然抗体进行位点特异性修饰的替代方案，Ball 及其同事使用亲和肽方法来提供能够在甲酰胺和重氮基团之间进行反应的金属催化剂（下图）。结合 Fc 的二铑金属肽是通过将三个 Glu残基引入Protein A 的Z结构域，然后用杂配二铑络合物金属化来制备的。在与抗体结合后，这种金属催化剂能够催化附近的Asn312残基与带有炔烃的重氮试剂的衍生化。得到的炔烃官能化然后通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成 (CuAAC) 反应将天然抗体与叠氮化物修饰的荧光团或药物结合。有另外的研究者开发了一种基于酶的催化作用，它利用sortase A突变体和Protein G B1结构域融合蛋白来指导IgG上特定赖氨酸的转肽作用。利用该方法修饰西妥昔单抗，LC-MS分析表明，修饰仅发生在重链 K5、K123、K135、K292 和 K441 和轻链 K207 上。与使用邻近导向反应物相比，邻近导向催化的优势在于催化剂不与最终产物共价连接，因此是“无痕的”。此外，邻近定向催化方法允许较低的配体摩尔比，可能限制脱靶结合。这些研究突出了邻近定向催化在位点特异性天然抗体标记中的可行性和益处，为该研究领域提供了有希望的新扩展。

小结：探针和蛋白质的特定天然残基（例如，赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸）之间进行选择性反应的邻近的偶联方法正在成为一类重要的抗体偶联方法。这些策略能够制备位点特异性抗体偶联物，而无需额外的抗体工程或额外修改。目前基于邻近的偶联的努力方向主要集中在新的邻近诱导化学以及对抗体结构和功能的破坏较小的抗体结合剂上。

由于位点特异性ADC具有的高治疗指数和出色的生化特性，目前许多努力都集中在抗体的位点特异性偶联策略上。目前已经开发了多种方法用于功能分子与抗体的特异性共价连接的方法，其中大多数都需要抗体工程在特定位点安装独特的反应性部分，然后使用生物正交化学选择性地修饰该部分。虽然这些技术能够极好控制偶联位点，但这些方法具有技术挑战和抗体工程策略缺乏通用性等缺点。因此，对天然抗体进行位点特异性偶联的方法更具吸引力。