临床有粉雾剂、气雾剂、喷雾剂、软雾剂等不同的吸入剂型，其递送方式及效率各不相同，临床给药方式也各有不同。不同的吸入制剂在非临床阶段可以采用的给药方式仅有气管内给药及吸入给药，气管内直接给药具有给药剂量精确、用量小的特点，但只适于早期药效毒理的初步评估，因气道内给药时上呼吸道没有药物暴露，无法评价其安全性，不适于正式的毒理试验[3]。对动物吸入给药可采用全身暴露及口鼻暴露两种模式，全身暴露模式因为药物消耗较大、存在非吸入途径吸收等问题逐渐被人们舍弃，目前一般推荐采用口鼻吸入给药模式。吸入试验与其他途径相比最大的特点在于给药系统复杂、设备要求高、过程复杂及影响因素多。

目前我国还没有针对吸入药物非临床评价的技术要求，国外仅经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）有吸入药物非临床试验技术指南[4]。非临床研究中要实现准确给药，通常需要开发动物专用的吸入器以模拟临床给药，匹配毒理试验要求。生物药吸入制剂对稳定性的要求较高，非临床试验中药物气溶胶的产生是一个难点。

吸入给药过程中，药物气溶胶颗粒能否被吸入肺部并在肺部沉积很大程度取决于气溶胶的空气动力学粒径。气溶胶颗粒的空气动力学粒径是颗粒随气流运动能力的特征参数，以气流中具有相同沉降速率的单位密度球形颗粒粒径表示，用于描述在重力作用下颗粒在气流中的沉降情况。只有具有足够小的空气动力学粒径的药物气溶胶才可能随着吸气进入肺部。

在大鼠吸入毒理试验中，当药物气溶胶粒径介于1~4mm 时，随粒径增大，口咽部及气管的气溶胶沉积量会轻微增加，同时肺部的药物沉积量相对稳定；当粒径大于4mm 时，气溶胶颗粒在口咽部及气管的沉积量明显增大，而肺部的沉积量则急剧减少[5]；而当粒径过小（<1μm）时，气溶胶则会随呼气呼出。粒径较小的颗粒会主要沉积于肺泡，难以发挥针对气管的药效作用。有报道，轻微哮喘患者吸入药物适合的粒径应为2.8μm，表明粒径范围选择对不同疾病的重要性。啮齿类动物的呼吸道解剖结构与人差别较大，导致气溶胶的沉积分布差别也较大；而犬及非人灵长类肺部的气溶胶沉积分布特征与人更为接近。在毒理学实验中，推荐的气溶胶颗粒空气动力学中值直径（median mass aerodynamic diameter，MMAD）数值应介于1~4mm，而几何标准差（geometric standard deviation，GSD）应介于1.5~3 之间。

有药学研究表明，在吸入毒理学实验中仍然需要伴随进行气溶胶粒径的检测，确保药物气溶胶可以被动物吸入。气溶胶空气动力学粒径的检测方法首选基于质量检测的碰撞法，而其他物理方法需要与碰撞法对比，只有当验证其适用性后才可用于试验[4]。目前粒径检测的“金标准”是基于高效液相色谱（high performance liquid chromatography， HPLC）等分析方法进行质量计算的级联碰撞法。激光飞行法属于光学方法，使用过程中难以区分药物与辅料，无法做到对活性药物成分（active pharmaceutical ingredient，API）的准确定量，尤其对于干粉制剂中的辅料乳糖颗粒的结果干扰较大，该方法不适合使用。

吸入给药与其他给药途径的明显区别在于，吸入药物是由动物伴随呼吸动作主动吸入的，这带来几方面的问题：①剂量无法准确定量，只能估算；②动物的状态与呼吸模式会改变吸入的药量；③即使估算了递送剂量，实际吸入的气溶胶药物在被吸入后可能紧接着就被呼出，无法完全沉积并被机体利用。

吸入实验中剂量的表述包括递送剂量和沉积剂量（递送剂量指气溶胶经发生后经动物吸入的气溶胶药量，沉积剂量指吸入的气溶胶最终沉积在肺部的药量）。递送剂量的计算公式为：Dose=RMV×C×D×F/BW（RMV：动物的每分钟通气量，C：吸入气溶胶的浓度，D：吸入的持续时间，F：可吸入的气溶胶颗粒比例，BW：体重）。此公式适用于从大鼠到犬等不同的动物。国际吸入毒理学会（AIT）对该公式中的参数进行了规范：RMV=0.608×BW 0.852[6]。与估算法不同，有的实验室实际检测动物的每分钟通气量，然后代入公式计算，该方法实际操作难度大，设备要求高。对毒理实验资料中的数据进行分析，实际检测的每分钟通气量用于计算剂量与公式估算的剂量结果接近。

为提高给药剂量，可分别提高气溶胶浓度或延长给药持续时间[5]。每个吸入药物由于处方和发生装置的差异，能实现的最大气溶胶浓度各不相同，但通常有一定限度。因此，通过延长给药时间以最大程度地提高给药剂量是更现实的做法。出于动物福利的考虑，在重复给药毒性实验中，最长的持续给药时间一般不超过6 h/d[7]。鉴于气溶胶药物的不稳定性，吸入毒理学实验中应对递送剂量的稳定性进行检测，定期取样，计算递送剂量的偏差范围。根据OECD 的指导原则，此偏差范围不应超过20%[7]。

药物的递送剂量是估算剂量，实际能沉积在肺部的药量即沉积剂量才更接近起效剂量。沉积剂量除受到动物呼吸频率、潮气量、气道解剖结构及药物粒径的影响外，也受到动物种属因素的影响。不同动物种属的药物沉积比例也不同。一般认为，大鼠体内递送剂量的10%可最终沉积到肺部，而犬体内递送剂量的25%可实现沉积[8]。通常基于这个固定比例对吸入毒理学实验中的沉积剂量进行粗略估算。沉积剂量并非药物最终的起效剂量。

沉积于肺部的药物颗粒将面临黏液-纤毛清除系统的外排作用，有的药物在吸入后会有80%~90%的药量被外排至口咽部直至胃肠道[9]，此时胃肠道吸收成为吸入毒理学实验中伴随的吸收途径，只有未被外排的存留药物经溶出并被吸收后才能进入机体真正起效。临床上可以采用令患者吞服活性炭的方法来检测药物经胃肠道的吸收情况；但在非临床吸入毒理学实验中，存留剂量由于受到药物颗粒的分布、溶出及气道生理状态等因素的影响，实际上难以估算。

准确给药是吸入毒理实验的首要条件。要实现给药剂量的准确与均一，在实践中需要：①进行充分的预实验，对受试物气溶胶的发生特点有充分了解，准确控制影响参数；②实验前对动物进行充分驯化，令其熟悉接受吸入给药的保定环境，减少给药过程中的应激，对于不适应的动物要及时剔除；③实验过程中进行密切的浓度检测、环境检测，对任何可能导致异常的因素及时修正。

药物气溶胶是一个处于持续变化中的不稳定体系。在给药过程中维持稳定的药物气溶胶持续递送对准确给药非常关键，但不能确保准确给药。气溶胶药物是经由动物主动吸入的，而动物的自主呼吸容易受环境因素影响，如在应激情况下动物呼吸模式可能浅而快，而在安静状态下通常慢而深，不同的呼吸模式会导致吸入的气溶胶的量产生差异。这种动物的个体差异通常无法有效监测，可能对试验结果带来影响。在口鼻吸入模式下，动物受到强制保定，应激反应较大，可能改变呼吸模式。异常的温湿度，过低的氧气或过高的二氧化碳，均易导致动物呼吸模式改变，进而改变给药剂量。为解决上述问题，①需要在实验前对动物进行驯化，令动物熟悉保定条件，减少应激；②需要在给药过程中监测各种环境参数，确保温度、湿度、氧气、二氧化碳等参数处于适当范围，确保在设定的保定条件下无异常环境应激。

吸入药物经吸入途径给药后直接进入肺脏然后进入动脉血，毒性反应可能较其他给药途径更大。大鼠吸入毒性实验中常见的一个毒性反应是喉部表皮的鳞状化生[12]。对上市吸入药物的毒理实验结果分析显示，在26 个啮齿类动物的吸入毒理学实验中，24 个发现了咽喉部的鳞状化生；同样的药物在26 个大动物的吸入毒理实验中仅有3 个发现了咽部病变[13]。国内实验室研究结果同样存在类似现象，大鼠吸入给药后常见上呼吸道包括咽喉部的炎性反应，而比格犬及食蟹猴则比较少见且程度也较轻。

通常认为这种喉部的鳞状化生是一种适应性反应，其较高的发生率有生理及解剖方面的原因。大鼠的咽喉与鼻甲在解剖结构上基本成直线排列，导致任何吸入的颗粒物均易直接撞击在咽喉的前表面。而人的咽喉与鼻腔成接近90°的直角，临床上极大减少了颗粒物撞击在咽喉表面的概率。大鼠呼吸频率比人快得多，平均吸气速率更快，这也导致了颗粒物更容易撞击在咽喉部。此外，大鼠咽喉的表皮层比其他种属更薄，客观上也更敏感[14]。喉部表皮反复暴露于颗粒物，会引起炎性刺激反应，表面纤毛丢失，导致鳞状细胞增生及角质化[15]。研究表明，经恢复期后，这种鳞状化生可部分或全部恢复，且目前没有报道这种化生可导致癌变。由于大鼠喉部高度敏感，一般认为比格犬或食蟹猴的吸入毒理学实验结果与临床相关性更强[13]。目前认为大鼠咽喉部病变是非特异病变，无明显临床意义。

相对不溶的药物颗粒可减少全身吸收，但长期给药易导致药物颗粒在肺内的蓄积。肺泡内蓄积的药物颗粒主要由巨噬细胞吞噬后运送至小气管，经由黏膜-纤毛清除作用外排，或者迁移至肺间质运送至淋巴结。不同种属动物的肺组织清除能力差异较大。据报道，固体颗粒在肺泡的滞留半衰期大鼠为70 d，人类高达700 d[18]。所有药物颗粒在沉积于肺泡后6~12h 内均被吞噬，但此过程具有显著的粒径依赖性。对肺巨噬细胞来说，最适于吞噬的颗粒介于1~3μm 之间，越小的颗粒对应的吞噬速率越慢[19]。未被吞噬的大分子及固体颗粒，如肺深部的纳米颗粒，可到达肺上皮、肺间质、血液循环系统甚至淋巴结。一旦颗粒物进入血液循环，将分布至全身。

巨噬细胞的聚集是吸入毒理实验中常见的肺内病理改变，但难于区分是正常的适应性反应还是具有病理意义的改变，因为正常动物肺脏巨噬细胞的聚集也常见。对多项吸入毒理实验的结果分析发现，5.6%动物在给予空气后肺脏中可看到巨噬细胞的聚集[20]。有研究者认为巨噬细胞数量上的简单增加应视为生理上的适应性反应，而非毒性反应[21]，这种巨噬细胞聚集通常是非特异性的，主要由不溶性的颗粒引起。但当药物颗粒持续蓄积并过载时，可能触发病理改变，不仅有巨噬细胞的聚集还伴有炎性细胞浸润、表皮或间质细胞的改变或纤维化等[22]。对于吸入药物来说，一般的临床用药虽不能达到引起巨噬细胞过载的剂量，但仍然提示研究者非临床试验的剂量设计要注意避免过高的肺部蓄积，以免带来与临床意义不相关的毒性风险。

巨噬细胞聚集的病理改变是由药物颗粒起的巨噬细胞非特异性聚集还是药物药理作用或毒性作用导致的聚集，通常也难以分辨。在单次吸入给药毒理学中观察到的一定程度的巨噬细胞聚集一般可以恢复，通常为适应性改变；重复给药毒理学实验中的巨噬细胞聚集则可能导致肺部不可逆的病理改变。有研究表明，大鼠对于肺部颗粒物过载比小鼠与仓鼠更为敏感[23]，这种敏感性与动物间不同的生理反应相关。有研究分别给予大鼠、仓鼠连续13 周吸入氧化钛颗粒后，发现在大鼠的肺淋巴结中蓄积了更高的氧化钛颗粒，而仓鼠吸入的氧化钛主要蓄积于肺泡。大鼠肺内的中性粒细胞比例也更高，并且在52 周的恢复期内并未恢复。仓鼠肺内的中性粒细胞比例在恢复期开始时为55%，在52 周恢复期结束后降低为10%[23]。大鼠的特点易导致持续的肺部炎症反应，最终容易带来致癌风险。大鼠的特点与其他实验动物种属和人类并不相同[24]。小鼠与大鼠有相似的肺泡结构，而非人灵长类与人的肺泡体积更大、结构更为复杂。虽然有更高的颗粒物沉积率及更慢的颗粒物清除率，但人的肺部颗粒物过载并不常见。这些差异提示，在解读吸入毒理学实验结果时，需要特别谨慎。目前尚无针对吸入毒性反应的指导原则。另外，在非临床试验中可以对动物的肺脏进行病理观察，评价巨噬细胞的聚集情况；但临床上，目前缺乏有效的工具进行相应的评价，无法对临床上的巨噬细胞聚集进行检测，临床上不同水平的巨噬细胞聚集的病理意义还缺乏数据说明。

除巨噬细胞聚集外，肺组织的损伤还包括肺泡及支气管上皮增生、急慢性炎症、沉积药物引起的血管损伤及血栓形成等，但这些病变在药物吸入毒理实验中比较少见，可能与毒性较大的药物在早期毒性筛选中即被淘汰有关。

目前上市的吸入生物药仅有吸入阿法脱氧核糖核酸酶(Pulmozyme，European Pharma)，凸显了吸入生物药的开发难度。目前处于临床开发中的吸入新药中生物药约占25%，可望在未来为临床提供更多的吸入治疗机会。区别于小分子药物，生物药非临床评价过程中的免疫原性是面临的主要问题之一。通常免疫原性需要通过对抗药抗体（antidrug antibodies, ADA）的检测而确认。重复给药过程中，较大的药物与ADA 复合物沉积于肾、滑膜、脉络丛，不能被免疫系统清除时将可能导致组织损伤甚至器官衰竭[25]。蛋白类药物在气溶胶发生过程中存在稳定性问题，可能发生凝聚[26]，进而增加免疫原性。除选择适当的气溶胶发生器之外，生物药的非临床研究还需要基于科学的原则选择适当的动物模型，降低免疫原性，确保非临床数据可以向临床转化。

在吸入毒理实验中，难溶的化药颗粒物存在巨噬细胞聚集和炎性细胞浸润而引发肺部炎症的风险。相对而言，吸入生物药很少引起肺部炎症，仅当生物药蛋白分子结构存在较大的种属间差异时，才更容易观察到肺部的炎症反应[27]。这种炎症反应多为产生的抗药抗体与药物结合形成的免疫复合物所致。在这种情况下，动物实验中观察到的毒性反应的临床预测价值较弱。国内实验室完成1 例吸入生物药的毒理学评价，大鼠连续4 周吸入给药毒理学实验发现与受试物相关的一系列病理改变，包括鼻腔呼吸道上皮炎性细胞浸润、肺脏剂量依赖性的巨噬细胞聚集、气管轻微至轻度淋巴组织增生。食蟹猴连续4 周吸入给药毒理学实验中，给药组仅发现肺和支气管轻度单个核细胞浸润，恢复期结束有所降低。受试物为生物类小肽，在伴随的免疫原性检测中，大鼠中检测出了较高滴度的抗药抗体，而食蟹猴中抗药抗体滴度较低。推测大鼠中较为严重且广泛的病变与受试物较大的种属间差异相关，应为抗药抗体引起的免疫毒性反应。