鉴于这些好处，连续工艺可能会解决病毒载体生产中出现的效率低下以及收率低的问题。病毒的特性和瞬时转染的性质使转向连续操作成为一项挑战。因此，重点更多的是工艺强化，而不是连续工艺本身。

病毒载体的批次工艺具有挑战性

病毒载体的批次生产主要是通过使用多个质粒瞬时转染人胚肾(HEK) 293 细胞来实现的。这个过程通常会受到低滴度的影响。贴壁细胞培养是最常见的，但目前正在转向基于悬浮的工艺，不过与重组蛋白和mAb 工艺中观察到的结果相比，细胞密度非常低。

尽管腺相关病毒 (AAV) 比慢病毒 (LV) 更稳定，但对于AAV 载体，转染步骤会导致大量“空”或“部分”病毒衣壳的产生，这些衣壳不包含完整的目标基因。与此同时，LV载体易受机械应力以及 pH 值和温度变化的影响而降解。这些因素导致下游纯化工艺中的低回收率。

从抗体的连续工艺中学习

Polyplus-transfection 的科学支持经理 Guillaume Freund 说，蛋白质的生产比病毒载体的生产更容易，因为载体产品的复杂性更高，其中涉及多种蛋白质，这些蛋白质包含在一个复杂的三维结构中，包裹着DNA。与蛋白质相比，病毒载体对用于生产它们的细胞的毒性也更大。

Charles River 的技术总监Tony Hitchcock 补充说，病毒载体的产品浓度比蛋白质产品低几个数量级，而且变化很大。此外，AAV载体不能像蛋白质那样分泌，而 LV 载体产品稳定性低。AAV 载体还需要分离完整的和空的衣壳，这比蛋白质和mAb 所需的分离更复杂。

“即便如此，围绕抗体建立的知识和专业技能仍可以作为开发连续病毒载体工艺的重要起点，”Freund评论道。然而，鉴于必须克服许多障碍，这个时间框架不会很短。

尽管产生病毒载体的转染不同于蛋白质表达，但用于转染步骤的细胞必须生长到适当的细胞密度。“类似于生产重组蛋白或单克隆抗体中的 N-1 生物反应器，细胞量实际上是细胞生长步骤的产物，因此灌流方案可能是合适的，使用与针对重组蛋白和单克隆抗体细胞培养工艺强化而开发的相同解决方案，”Pall制造科学和技术副总裁 Marc Bisschops 说。

Bisschops 表示，病毒载体的下游纯化步骤与蛋白质和mAb 的纯化步骤相似，因此，为后者开发的连续解决方案原则上也可应用于病毒载体工艺。他补充说，关键工艺参数不会有根本性的不同，对诸如生物负荷控制等关键方面的期望将保持完全相同，但规模可能并不总是合适的。

一般来说，虽然大多数应用于病毒载体工艺的技术都是从其它药物模式中继承来的，但Univercells Technologies 的首席技术官Tania Pereira Chilima 指出，一些技术是专门设计用于实现病毒生产中的集成和连续工艺。她重点介绍了Univercells Technologies 的上游-中游生物生产平台，该平台在以批次循环或灌流模式运行的固定床生物反应器中集成并自动化细胞培养、转染/感染或诱导以及病毒生产，以及随后的单元操作，以在下游工艺之前，提供澄清和浓缩的收获液。

在连续工艺可能实现之前，要解决的许多问题

大多数连续工艺的开发工作都集中在使用平台工艺生产的传统生物药上，这些平台工艺对工艺有深入的理解，对工艺行为有更大的确定性。Cytiva的企业解决方案总监 Joe Makowiecki表示，在仍被认为是新产品模式的病毒载体领域，缺乏这种知识库。

“病毒对环境和工艺条件的敏感性，以及病毒比传统蛋白质和单克隆抗体更大的事实，以及有限的行业经验和专业知识，使得病毒载体工艺更难实施工艺强化解决方案，”Makowiecki说.

Bisschops 观察到，特别是目前进行的转染步骤，对于将病毒载体生产的上游工艺转变为一个完全集成的连续生产平台来说将是一个挑战。

例如，Polyplus-transfection的产品经理 Maxime Dumont 指出，由质粒 DNA 和转染试剂生成的转染混合物稳定性有限，确定最佳添加时间范围至关重要。“需要产生更稳定的转染混合物的转染试剂才能在真正连续的操作中进行瞬时转染，”他说。Freund 补充说，与可生物降解的转染剂结合的复合物需要有更好的稳定性，以延长转染过程可以进行的时间。

瞬时转染带来的问题可能会随着生产细胞系的发展而得到解决，这些细胞系可以在不需要瞬时转染的情况下产生载体。然而，根据ViroCell Biologics 的工艺开发总监Carlo Scala 的说法，制备高滴度稳定生产细胞系非常困难。

此外，一些病毒，特别是 AAV 和腺病毒，是在细胞内产生的，因此需要在转染步骤后对细胞进行化学裂解，然后用核酸酶处理以降解细胞DNA。Hitchcock指出，以连续的方式执行这样的步骤是不可能的。他补充说，为了分离空衣壳和完整衣壳，许多制造商仍在使用超速离心机，虽然有连续超速离心机可用，但要达到所需的纯度可能具有挑战性。

Bisschops 强调的另一个挑战是目前病毒载体生产的规模。这些产品的应用通常针对较小的患者群体，因此批次规模比大多数mAb 治疗药物小得多，并且需要仍然符合当前良好生产规范(CGMP) 的较小生产系统。“随着工艺强化和/或连续生物工艺的发展，实现此类系统的挑战可能会变得更加重要。连接器和传感器等一次性组件并不总是以合适的尺寸提供，以支持适当的规模，”他解释说。

针对瞬时转染的灌流工艺潜力

Scala 说，如果能够开发出解决方案，上游病毒载体生产可以极大地受益于连续生产。Chilima表示，对于分泌的、细胞外不稳定的产品（例如LV 载体），连续工艺可以实现连续的病毒收获、澄清、浓缩和冷却。

虽然接种和病毒生产并不总是能够转化为连续工艺，但有一些技术正在被研究作为工艺强化的推动力。例如，固定床生物反应器的使用允许贴壁细胞在非常紧凑、完全受控的生物反应器而不是扁平器皿中生长。“转染过程和细胞裂解都可以在生物反应器中进行，从而最大限度地减少操作员干预并在整个病毒载体表达过程中保持良好控制（和功能性封闭）状态，”Bisschops观察到。

据 Dumont 介绍，其它病毒载体制造商正在通过从批次模式转换为补料分批模式来实现连续工艺。“使用灌流工艺作为增加生物量的一种方式是强化转染过程的一种很有前途的手段，”他指出。关键是置换耗竭的培养基，从而提供更优化的转染条件。虽然灌流的使用将取决于生产途径，但Hitchcock解释说，使用基于灌流的工艺可以在病毒感染或质粒转染之前，增加细胞密度，以提高生产力，或在诱导稳定细胞系生产之前，这两者都是为了提高产量。

这种方法必须解决的一个挑战是 HEK 细胞倾向于在更高的细胞密度下聚集。细胞聚集会显著限制瞬时转染步骤的效率。“有必要改进和优化培养基以及生物反应器参数，以减少或防止更高细胞密度下的聚集，”Makowiecki说。

强化下游操作的机会

鉴于许多载体（尤其是 LV 载体等囊膜载体）对剪切力、高盐浓度和温度降解的敏感性，下游工艺的时间安排对于避免产品损失至关重要。因此，Scala强调上游载体的连续生产和收获必须与快速、高效的下游工艺相结合。

Makowiecki 表示，事实上，与重组蛋白和mAb 一样，载体纯化步骤可能非常适合工艺强化，从而提高产量和收率。

Chilima 指出，即使对于细胞内血清型而言，由于必须裂解细胞以收集产品（在工艺结束时以批次工艺模式进行），因此上游连续工艺可能受益较少，但下游操作中的连续工艺将是有益的。“使用模拟移动床层析 (SMB) 等连续工艺技术可能会带来更高的产能利用率、更快的工艺时间和更低的试剂使用量，以及其它好处，”她说。

Makowiecki 观察到，层析也可以通过使用大孔分离介质（如基于膜和纤维的设备中的分离介质）来强化，这些介质可以更有效地处理更大的病毒分子，从而实现快速循环。“应用这类解决方案的关键是确保整体系统（泵、流路和设备）不会因更高的流速而造成中断，”他评论道。

然而，Bisschops 警告说，众所周知，涉及梯度洗脱的层析步骤更难转化为连续工艺。即便如此，他强调在下游病毒载体生产中仍有许多工艺强化的机会。一个具体的例子是精纯步骤，其中膜吸附技术可用于有效分离完整的和空的衣壳。同样，较大孔径的膜吸附对较大的产品（如病毒载体）有效工作，因为它们减轻了在传统填料/基球层析介质中观察到的缓慢扩散行为。

Hitchcock表示，其它技术，如使用单程切向流过滤(TFF) 以减少层析操作之前的工艺体积以及置换缓冲液，可能很适合下游病毒载体纯化工艺。“对于回收和纯化步骤，减少工艺时间和减少产品损失是关键驱动力，而这些技术提供了实现这一目标的潜力，”他解释道。

不过，Bisschops 警告说，下游病毒载体工艺中的许多过滤步骤无论如何都是在流穿模式下操作的，并且调整这些过滤器的大小以适应整个批次，而不是将这些步骤配置为循环连续模式，可能会产生很多的意义。

需要稳定生产细胞系

瞬时转染步骤本身并不容易转换为连续工艺。需要不稳定的转染试剂-质粒复合物以及病毒产物对用于载体生产的 HEK 细胞有毒的事实，只是使连续操作变得困难的两个特征。

因此，为了使连续工艺成为可能，需要能够在很长一段时间内以高滴度生产病毒载体的稳定生产细胞系。Hitchcock指出，稳定细胞系提供了提高产量水平的潜力，但也提供了更一致的生产力水平。

“拥有一个足够大的生物反应器和稳定生产细胞系，为后续的下游纯化提供足够的材料，将允许运行有效的连续工艺，”Scala说。ViroCell Biologics 首席科学官 Farzin Farzaneh 补充说，反过来，通过稳定的载体生产细胞连续生产载体可以显著提高产量并降低成本和生产时间。

Farzaneh 表示，包括ViroCell 的创新和工艺开发团队在内的许多团队正在致力于产生稳定的、高滴度的载体生产悬浮细胞。事实上，已经为LV 载体开发了一些稳定细胞系，许多研究人员也在研究AAV 细胞系。

“获得稳定的病毒载体生产细胞系是行业内的自然进展；哺乳动物细胞培养已经采用了这一途径，从而产生了该行业最常用的哺乳动物细胞系，中国仓鼠卵巢细胞。病毒载体正朝着同一个方向发展，”Makowiecki评论道。Scala 认为，最好的策略是继续投资于开发稳定生产细胞系，同时设计/开发可以生产的高滴度、更高物理稳定性的载体。

先进的纯化和过滤技术

对病毒载体和其它新模式的需求快速增长，导致人们对为这些具有挑战性的分子开发适合用途的下游纯化解决方案越来越感兴趣。

“在过滤器方面，可以为这些大型载体产品寻找减少产品损失的形式，特别是对于可能会遇到重大产品损失的囊膜LV 的工艺，”Hitchcock评论道。他重申，Pall的单程TFF 技术已被证明适用于 AAV 载体，而 Repligen 的切向流深层过滤系统为LV 产品提供了高回收率。

根据 Makowiecki 的说法，人们重新关注基于纤维的技术。他说：“中空纤维技术正在重生，其应用扩展到传统疫苗领域之外，可用于采用 TFF 工艺的新产品模式，这一工艺是重点。”

更新的纳米纤维技术也被引入市场，这些技术被设计用于病毒载体和其它大分子，如质粒DNA 和信使 RNA。“这些纤维技术可以很容易地用于强化层析工艺，”Makowiecki观察到。

基于纤维的新型层析形式，例如来自Cytiva 和 Astrea 的层析技术，非常适合大型生物复合物，并在流速和改进的结合-洗脱动力学方面显著减少工艺时间，这是高通量工艺平台所需的，Hitchcock观察到。

Makowiecki 预计此类技术将首先用于新模式的批次工艺，然后将在这些操作中获得的知识与围绕传统生物药连续工艺开发的知识相结合，以开发新模式领域的连续解决方案。

除了新的纤维技术本身，还有大量工作正在开发新的配基，以连接到纤维上，以及用于更传统的、基于层析填料的基球和膜。“我们已经开始看到许多不同类型的配基与基质结合使用，不仅基于大孔介质，还基于更传统的层析介质。这些亲和配基对特定载体和载体血清型具有特异性。不过，最终会出现更广泛的、特定于载体并为许多不同血清型提供良好性能的配基，就像用于mAb 的Protein A 一样，”Makowiecki 说。

恰当的分析解决方案也必不可少

如果不获得实时的过程中分析数据，就不可能进行连续工艺。在Bisschops 看来，连续生产病毒载体的最大障碍很可能是分析方面。“适当的过程控制和快速的周转时间是进一步推动工艺强化的必要条件，”他说。

Hitchcock表示同意，最大的挑战之一将是过程分析，既涉及在操作期间确定产品浓度的能力，也涉及实施所需的控制、以确保工艺的一致性和稳定性。

Hitchcock强调的一个特殊问题与当前过程分析技术检测病毒载体生产中遇到的极低蛋白质浓度的能力有关。“通常需要改进在线监测和控制系统，这种能力对于病毒载体的连续工艺至关重要，”他观察到。

从积极的方面来说，Bisschops 注意到正在取得的进展将有助于增强对生产过程的理解和质量标准，同时减少生产中的可变性，并因此提高产品质量的一致性。“这些发展是进一步提高工艺效率和推动病毒载体生产工艺强化的关键，”他总结道。

潜在的监管优势

根据 Hitchcock 的说法，从监管的角度来看，改进的过程分析技术对于连续病毒载体生产也至关重要。“过程分析产生的数据对于显示操作过程中的产品一致性至关重要，无论是在纯度方面，还是在效力和与通过批次工艺生产的材料的可比性方面，”他解释道。

幸运的是，监管机构鼓励连续工艺，因此为病毒载体制造商提供了机会，使生产平台的开发和表征与监管预期保持一致，Bisschops表示。

“如果我们对工艺强化采取更全面的观点，节省时间似乎是一个很好的科学领域，在这个领域中，从常规生物药产品开发中学习的知识可以大有帮助。例如，使用质量源于设计(QbD) 的原则可以在病毒载体的临床开发早期解决监管挑战。通过这种方法，可能可以缩短上市时间，同时降低风险和监管挑战，”Bisschops说。

在这方面，Pall 发布了一个将 QbD 用于AAV 载体的框架，以支持科学家在工艺开发的早期阶段解决监管方面的问题。

一切为了提高效率

虽然连续工艺可以提供可衡量的好处，但在完全连续模式下部署病毒载体生产之前显然存在重大障碍。甚至连续工艺可能不是一个合适的解决方案。

“转向连续操作的驱动力是提高效率、生产力和整体质量。很多时候，这可以通过优化、新产品推出和强化相结合的方式来实现。实现提高效率、生产力和质量的目标应该是重点，而不仅是为了实施连续的解决方案，”Makowiecki强调说。

Hitchcock表示同意，行业很可能会以逐步的方式引入连续工艺，随着赋能技术的出现，特定的单元操作会变得更加强化。他指出：“将根据与成本收益和产品质量方面可证明的运营效益相关的技术成就来进行工艺强化。”

Dumont 补充说，在连续上游工艺成为现实之前，必须开发稳定生产细胞系，其产量与瞬时转染工艺一样多。不过，他同意完全连续的操作可能永远不会对病毒载体起作用，并且可能需要其它提高生产力的方法。

事实上，连续的病毒载体生产可能不是行业直接关注的一个领域，因为驱动力可能不足以解决所涉及的障碍，Bisschops补充道。相反，他认为，一种更倾向于从整体角度看待工艺强化的方法，包括缩短开发、技术转移和监管审批的时间，可能会增加更多价值。

“在我看来，我们不应该将连续生产本身作为一个目标。连续生产是工艺强化的一个子集。这有很多角度，但不限于降低生产成本。它还包括以更智能的工作方式来缩短开发时间，”Bisschops评论道。他补充说，现有技术，例如用于贴壁细胞培养的固定床生物反应器和用于层析纯化的膜吸附，已经可以用于支持病毒载体生产的工艺强化。

本文为以下文献内容简介，详细内容，请参考原文。来源：生物工艺与技术

原文：C. Challener, “Continuous Processing for Viral Vectors,” BioPharm International 35 (8) 2022.