【药厂】如何做好培养基？

PHT制药业 2022-04-21

培养基(Medium)是指供给微生物、植物或动物生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐、维生素和水等几大类物质。培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料。在生物制药过程中，细胞培养基发挥着重要作用。

不同培养基可根据实际需要，添加一些自身无法合成的化合物，即生长因子。

例如：高氏一号培养基（淀粉琼脂培养基）制作：在烧杯中加水95毫升，加热至沸腾，取可溶性溶粉2克，用5毫升水调成糊状，倒入沸水中和匀。再称取其它药品，陆续加入烧杯内（待一种药品溶解后，再加入第二种药品）。待全部药品溶解后，停止加热，补足失水，调pH值至7.2～7.4。分装后，高压蒸汽灭菌。本培养基常用于培养放线菌。

例如：肉汁蛋白胨液体培养基的制作：取新鲜牛肉500克，去净脂肪、筋腱后，绞碎或剁碎，加水1000毫升浸泡，15℃下放置12小时或50℃下放置半小时。用纱布将肉汁过滤，补足失水。向肉汁中加入蛋白胨和食盐。将肉汁加热，放入苏打（碳酸钠）至红色，调整pH值。分装，高压蒸汽灭菌。将上述已灭菌的培养基用棉花滤去凝集的蛋白质，制成液体培养基，如需制成固体培养基，可在每100毫升液体中加入2克琼脂，加热溶化后，分装，再次进行高压蒸汽灭菌。常用于培养细菌。

例如：豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）培养基的制作：称取新鲜黄豆芽100克，放入烧杯中，加1000毫升水，煮沸30分钟，用纱布过滤，补足失水。再加葡萄糖（或蔗糖）50克，琼脂15克，加热至融化，补足失水。分装，加棉塞，高压蒸汽灭菌。常用于培养霉菌。

为满足生物产品的生产需求，必须支持高密度细胞的生存，促进生物产品的合成和细胞外运输。培养基的制备程序不同类型培养基制备的程序也不尽相同。培养基按状态分有固体培养基和液体培养基,一般培养基需要完成以下十个主要步骤：选择配方、记录制备、称重成分配料、配制溶液、调整成分，矫正pH、澄清过滤、分装、灭菌及检定等,过程中要要注意培养基的温度,各类营养物质的浓度的比例, PH值,用水和营养液配置,要注意碳源和氮源的浓度的比例。

为了使菌能正常生长发育，培养基除了必须有足够的碳、氮营养外，还应注意碳与氮的比例（碳氮比，C/N）。这样既能保证营养生长阶段对营养的需要，也能保证生殖生长的顺利进行。例如，巴西蘑菇培养料适宜的碳氮比（C/N）为28～30∶1，含氮量1.4%～1.6%，投料量30～35千克/米²。

1.选择培养基配方：同一种培养基，其表达方式往往存在着差异。所以，除了应当严格按照标准方法的规定编制之外，我们一般应尽可能收集有关数据，加以比较和核对，然后根据自己的目的选择和记录数据来源
2.记录培养基的制备：培养基的制备记录包括培养基的名称、配方及其来源、pH值、灭菌温度、时间、配制日期、制备人等，并且要复印记录和保存原始记录备查。对副本的记录应该和培养基一起保存，以防出现混乱。
3.称重培养基的成分配料：培养基成分要准确称量，并注意防止混淆。每一种成分称量完毕后，都要在分装的一面打上记号，然后将分装的药物一起放在左边。每一个成分称量完之后，都会向右移动。全部称量完毕，应再次检查。按培养基处方准确称取各种成分，先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入各种成分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。
4.配制溶液：向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后补足所需水分。对蛋白胨、肉膏等物质，需加热溶解，加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。配制固体培养基时，先将上述已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化。并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦。
5.调整培养基成分：介质中使用的化学物质应该是化学纯品，铜锅或铁锅易导致铜、铁混入培养基，使细菌难以繁殖。用不锈钢锅加热溶解较为适宜。将各种成分混匀于水中，*以流通蒸汽溶化半小时，如在电炉上溶化应随时搅拌，如有琼脂成分时geng应注意防止外溢。溶化完毕，补足失去的水分。溶解于水的锅子，可用温水加热，随时搅拌，防止结焦。若发现结焦，则不能使用介质，需重新调配。在溶解大多数固体成分之后，用少量热将其全部溶解，直到沸腾。
6.调整培养基的pH值：由于加热消毒过程中培养基的 pH值会发生变化，因此应在培养基组分完全溶解后，调整 pH值。用pH试纸（或pH电位计、氢离子浓度比色计）测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。举例来说，牛肉汁的 pH值下降了0.2左右，而肠浸出物的 pH值则明显上升。所以，在这一步中，操作者要注重不断探索经验，掌握培养基的最终 pH值，保证培养基的质量。pH测定，取与标准管同口径的试管（通常用华氏试管）3支，于第1、3管各加入欲测定pH的的培养基5ml，并于第1管中加入0.2g／L的酚红0.25ml作为测定管，混匀于第2管加入蒸馏水5ml，第4管为pH标准比色管。pH的校正，若测定管过酸或过碱可用0.1mol／L氢氧-化钠或0.1mol／L盐酸溶液矫正，直至颜色与标准管相同为止，加碱或加酸时要精-确缓慢，每加1滴后要充分混匀，比色后再加第2滴（有时仅加半滴）准确记录加入的量。计算，设5ml培养基矫正pH至7.4时需0.1mol／L氢氧-化钠0.15ml，现有培养基4990ml，需加氢氧-化钠的量可按下列方法计算：5∶4990＝0.15∶X X＝0.15×4990/5＝149.7（ml），如将此0.1mol／L的氢氧-化钠改用1mol／L的氢氧-化钠时，则需14.9ml即可。在调整 pH值后，要将其煮沸几分钟，以利于培养基沉淀。
7. 过滤澄清：用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。培养基配制后一般都有沉渣或混浊出现，需过滤成清晰透明后方可使用，常用的过滤方法如下：液体培养基必须清晰，以便观察细菌的生长情况，常用滤纸过滤，亦可在加热前加入用水稀释的鸡蛋白（1000ml培养基用1个鸡蛋白）在100℃加热后保持60～70℃40～60分钟，使其不溶性物质附于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以滤纸过滤。固体培养基如系琼脂培养基，于加热融化后需趁热以绒布或两层纱布中夹脱脂棉过滤；亦可用自然沉淀法，即将琼脂培养基盛人铝锅或广口搪瓷容器内，以高压（103.43kPa）蒸汽融化15分钟后，静置高压锅内过夜，次日将琼脂倾出，用刀将底部沉渣切去，再融化即可收清晰的琼脂培养基。
8. 分装与加塞/包扎：已过滤的培养基应进行分装。如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中。如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基，则须将培养基分装于锥形瓶内。分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。装入试管的培养基量，视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。分装完毕后，需要用塞堵住管口或瓶口。堵塞的主要目的是过滤空气，避免污染。塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。
9. 灭菌：不同成分、性质的培养基，可采用不同的灭菌方法。高压蒸汽灭菌法：高压灭菌的温度与时间随种类及数量的不同有所差别，一般少量分装时高压（103.43kPa）灭菌15分钟即可，分装量较大时，可高压（103.43kPa）灭菌30分钟，含糖的培养基高压（55.16kPa）灭菌15分钟。以免糖类被破坏。某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50°C左右的培养基中。琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55℃-60℃时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。
10．检定保存：培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。每批制成后须经检定方可使用，检定时将培养基放37℃温箱内培养24小时后，证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使用。制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤做为宜。每批应注明名称，分装量，制作日期等，放在4℃冰箱内备用。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。