NMPA于2022年04月11日发布了《双特异性抗体类抗肿瘤药物临床研发技术指导原则（征求意见稿）》，预示着国内双特异性抗体类药物的研发逐步进入高速发展阶段。
双特异性抗体的概念最先在1960年[1]首次提出，是指同时具有两个不同抗原结合位点的抗体，此类型抗体能同时特异性结合两种抗原或两个表位。双特异性抗体在自然条件下并不存在，它们通过基因重组、化学偶联或四重杂交瘤的方式构建，相比于传统的单克隆抗体，BsAb的灵敏度和特异性更高，具有募集免疫细胞、双重阻断信号通路等功能，近年来BsAb类药物在肿瘤免疫治疗、抗感染、自身免疫性疾病等领域快速发展，从而实现“1+1>2”的治疗效果。
1. 临床治疗优势
与单抗相比，BsAb因其具有额外的特异性抗原结合位点，显示出以下治疗优势：
增强疗效
：双特异性抗体的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，双特异性抗体有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标记抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞。目前已经批准上市的其中2个双特异性抗体产品都属于这个类别，Trion Pharma公司开发的Catumaxomab能够靶向肿瘤表面抗原EpCAM和T细胞表面受体CD3，而Amgen公司开发的Blinatumomab可以同时结合CD19和CD3。两者都是通过激活并召集杀伤性T细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。
防止耐药
：BsAb因其同时结合双靶点，可阻断双信号通路。受体酪氨酸激酶（receptortyrosine kinase，RTKs）是最大的一类酶联受体，在细胞增殖过程中发挥重要的调节作用，如Her家族等。RTKs在肿瘤细胞表面异常高表达，导致肿瘤细胞恶性增生，因此也是肿瘤治疗的重要靶点。针对RTKs单靶点的单抗已在肿瘤治疗中得到广泛应用。但是，肿瘤细胞可以通过转换信号通路或通过HER家族成员自身或不同成员之间的同源或异源二聚体激活细胞内信号进行免疫逃逸。因此采用双特异性抗体药物同时阻断两个或多个RTKs或其配体，可以减少肿瘤细胞逃逸，提高治疗效果。
降低毒性
：利用双特异性抗体两个抗原结合臂可以结合不同抗原的特点，两个抗原结合臂分别结合癌细胞表面2种抗原，可以有效增强抗体对癌细胞的结合特异性和靶向性，降低脱靶等副作用。
降低治疗成本
：与传统抗体相比在组织渗透率、杀伤肿瘤细胞效率、脱靶率和临床适应症等指标方面都具有较强的竞争力，临床优势显著。特别在使用剂量方面，由于其治疗效果可以达到普通抗体的100-1000倍，使用剂量最低可降为原来的1/2000，显著降低药物治疗成本。相对于组合疗法，双特异性抗体的成本也远远低于两个单药联合治疗。
经最新统计，截至2021年底，统计的已获批药物靶点数量扩展到893个，其中667个
是人蛋白
。假设传统药物（不包括核酸药和细胞治疗）可开发的药物靶点共有1000个，所有生物技术和制药公司的共同竞争空间则受到极大的禁锢。但如果考虑双靶点或者多靶点的话，药靶空间会根据随机组合数增长，可解决药物研发靶点不足的困境，同时piggybacking模式下，将以前无法单独成药靶点的药物开发成为可能，未来将是双抗药或多抗药物全面爆发的时代。
1. 细胞因子风暴
细胞因子风暴是双抗细胞桥接机制下最大的毒副作用，这主要是由CD3的高亲和力和Fc介导的免疫效应造成[2]。CD3较高的亲和力可导致双抗在尚未结合肿瘤细胞时就活化T细胞，诱发细胞因子快速剧烈地释放，引发细胞因子风暴。同时CD3高亲和力也会加速药物代谢，减少双抗在肿瘤内的分布，影响药效。另外，双抗的Fc结构与其他效应细胞表面的Fc受体结合，同样也会诱发细胞因子风暴。已上市的Removab虽然具有较好的疗效，但由于其较为严重的副作用，导致该产品在2017年退市。因此，细胞桥接双特异性抗体的设计重点在于选择合理的抗体亲和力范围，在具有更强特异性的肿瘤靶点的同时，尽可能抑制Fc介导的效应功能。已上市的Blincyto（靶向CD3×CD19）去除了Fc结构，降低了T细胞过度活化的风险，两个抗体均采用单链抗体片段，不具备完整的IgG结构，降低了CD3亲和力。同时选择了肿瘤特异性较高的CD19靶点，安全性相对较好[3-5]。
2. 免疫原性
由于双特异性抗体的分子结构在自然中不存在，这大大提高了免疫原性的风险，同时降低了药物的安全性和疗效，产生抗药抗体(ADAs)和中和抗体，也可能导致通过形成药物/ADA免疫复合物和诱发严重的药物相关毒性反应或过敏反应[6]。多种因素可影响双特异性抗体的免疫原性，包括：产品相关杂质、抗体来源(人、嵌合)、给药方案、目标分子[6]等。由于BsAb在临床应用时间较短，关于免疫原性的数据也相对有限，如：接受Blinatumumab治疗的患者中仅有少于1%的显示ADA[7]。
与此相同，在其他B细胞靶向的双特异性抗体中，如Mosunetuzumab(CD20×CD3, 1 + 1 IgG)和Glofitamab(CD20×CD3, 2 + 1 IgG)，也没有报告ADA相关的问题。这可能与其作用机制有关。产生ADA的B细胞被双特异性抗体消除，导致ADA的消除。据报道，其他T细胞激活的双特异性抗体，如：PRS-343 （HER2×4-1BB），在给药2.5 mg/kg及以上的剂量时，有27.8%患者产生ADA[8]。由AptevoTherapeutics开发的ADAPTIR平台包含两个不同的scFvs连接到Fc域的N端和C端，ADAPTIR平台中的APVO- 414（PSMA×CD3）超过50%的患者产生ADA，导致进一步的临床研究被搁置[9,10]。AFM13 （CD30×CD16A）是以TandAb（四价串联糖尿病）为基础的BsAb，在15例患者中显示ADA，经治疗的28例患者中，半数检测到的ADAs具有中和作用[11]。
1. 国外进展
在1960 年，Nisonoff 等[1]将两个不同的抗原结合片段通过再氧化连接到一起，并证明了该产物可以募集两种不同类型的细胞。在此基础上，1983 年，Milstein等第一次使用融合的两种杂交瘤细胞生产出不对称结构的双特异性抗体[12]。1985 年，Perez 等第一次提出了可以特异性靶向 T 细胞表面受体 T3 和靶细胞表面抗原的双特异性抗体，该研究使用的靶细胞包括鸡红细胞和异种肿瘤细胞，揭示了效应细胞的重定向可以用于肿瘤或其他表达特异性表面抗原的病原体的体内治疗[13]，为基于双特异性抗体的免疫治疗奠定了基础。
1993 年，不含 Fc 段的双特异性抗体，二价的抗体二聚体Diabodies 首次出现[14]。1995 年，Lindhofer等解决了链交联问题，他们发现大鼠和小鼠杂交瘤的融合，可以使轻链与重链配对的正确率增加，这一发现使得双特异性抗体的产率显著增加，提供了其大规模生产的可能性[15]。自2009 年，世界上第一个双特异性抗体药物 Catumaxomab 在欧盟获得批准用于治疗 EpCAM 阳性的恶性腹水患者后，截止2022年4月，全球领域仅有6款已经获批上市的多特异性抗体，可见这一领域研发难度之高，这6款药物分别如下：
我国双抗研发虽然起步较晚，截至目前暂无获批药物。但近几年，国内紧跟国际研发脚步，国内诸多研发公司近年来开始布局这一领域。双抗的临床产品申报集中爆发，未来市场空间巨大。国内在该领域内领先的团队包括康方生物、康宁杰瑞、百利药业、武汉友芝友、信达生物、宜明昂科、普米斯、恒瑞医药、百济神州等，研发布局管线总数已超过60余款。其中，2021年8月24日，康方生物在宣布其PD-1/CTLA-4 双特异性抗体Cadonilimab（研发代号AK104）已递交上市申请，用于一线治疗持续、复发或转移性宫颈癌，该药有望于今年获批，成为国内首个获批上市的双抗药物，其市场价值预估达到50亿元。
国内在双特异性抗体领域布局的企业有很多，大部分项目尚在临床前阶段。从国内开发的靶点来看，以PD-1/PD-L1、CTLA-4及HER2为靶点的项目居多。从中国的临床申报情况来看，尚处于快速发展的初期，从临床到真正上市还有相当长的路要走。
1. 按照结构分类
双特异性抗体根据结构可分为2大类：含Fc片段的双特异性抗体（IgG-like双特异性抗体）与不含Fc片段的双特异性抗体（non-IgG-like双特异性抗体）。
IgG-like双特异性抗体：IgG样BsAb有Fc部分，具有Fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）和抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用（ADCP）。IgG样BsAb其Fc部分有助于抗体后期的纯化并提高其溶解性、稳定性，但相对分子量较大，且Fc部分与受体FcRn结合，增加了抗体血清半衰期，同时也具有较高的免疫原性[16]。此类抗体结构主要包括Triomabs/quadroma、DVD-Ig（dual variable domain Ig）、CrossMAb、Two-in-one IgG、scFv2-Fc[17-19]。
non-IgG-like双特异性抗体：非IgG样BsAb缺乏Fc片段，仅通过抗原结合力发挥治疗作用，具有较低的免疫原性、易于生产、分子量小等特点。因相对分子量较小，其在肿瘤组织的渗透性较高，因此具有更强的治疗效果[20]。这些BsAb有诸多形式，主要包括TandAb（tandem diabody）、scFv-HSA-scFv、BiTE（bi-specificT-cell engager）、DART（dualaffinity retargeting）、Nanobody[21-26]。
图3 双特异性抗体的结构类型[26]
根据作用机制的不同，FDA将双特异性抗体分为以下两大类：以“桥联细胞”的双特异性抗体和抗原交联的双特异性抗体。根据NMPA发布《双特异性抗体类抗肿瘤药物临床研发技术指导原则（征求意见版）》分为：桥联细胞、桥联受体、桥联因子三种作用机制的双特异性抗体。
第一类以“桥联细胞”的双特异性抗体。该类抗体通常包含这两个抗原结合位点：一个对T细胞（CD3）或NK细胞（CD16）具有特异性，另一个则可特异性结合肿瘤细胞的相关抗原（TAA）。该类双特异性抗体可在肿瘤细胞和免疫细胞之间“搭桥”，在与肿瘤细胞特异性结合后，通过另一抗原特异性地引导目标免疫细胞至肿瘤细胞周围，进而发挥细胞杀伤作用[27]。
目前开展的临床试验，大部分双抗为细胞桥联型。肿瘤端识别TAA（肿瘤相关抗原），免疫细胞端选择CD3（识别T细胞）或CD16（识别NK细胞）。肿瘤相关抗原（TAA）和肿瘤特异抗原（TSA）区别在于TAA在肿瘤细胞和正常细胞均表达，只是在肿瘤细胞占优势。TSA则仅在肿瘤细胞表达，正常细胞不表达[28-30]。
第二类“桥联受体”的双特异性抗体。该类双特异性抗体在相当于单抗的“进化版”，在特异性识别的两种抗原间发挥桥联作用，基于替代信号靶点补偿和加强阻断肿瘤细胞生长/存活的信号，或提高免疫细胞功能，或促进相关蛋白质复合物的形成，进而实现抑制肿瘤的效应。其可以靶向免疫细胞上的2个不同受体，也可以是作用于肿瘤细胞上的2个不同靶点，还可以靶向肿瘤细胞表面同一抗原的不同表位[31-34]。
第三类“桥联因子”的双特异性抗体。该类BsAb可以用于促进蛋白复合物和膜受体蛋白复合物的形成，提高抗体药物偶联物或激动性抗体的活性。例如，靶向凝血因子IXa和X的双特异性抗体可以通过同时桥联结合凝血因子IXa和凝血因子X，从而仿真FVⅢ的生理功能，促进凝血酶的产生。
图5 桥联受体和因子的双特异性抗体作用机制
1. 双特异性抗体相关指导原则现状
对于双特异性抗体的个药指南，FDA最早发布相关药物的研发指导原则，欧盟暂未发布针对双特异性抗体药物的个药指南，双抗类药物的研发和申报遵循治疗性蛋白药物的相关指导原则[35]。中国NMPA于2022年04月11日发布了《双特异性抗体类抗肿瘤药物临床研发技术指导原则（征求意见稿）》，预示着随着生物制药技术的发展，双特异性抗体类药物进入高速发展阶段，尤其是在肿瘤治疗领域，双特异性抗体类药物研发持续增长。
FDA于 2019年4月19日发布了《Bispecific Antibody Development Programs》指南草案，广泛征求工业界意见，工业界也对指南草案中多种表述表达了看法。因此，FDA在指南最终定稿时考虑了业界意见，并于2021年5月 24 日发布定稿版本，为工业界和参与双特异性抗体研究开发的各方提供了指导[36]。
NMPA发布《双特异性抗体类抗肿瘤药物临床研发技术指导原则（征求意见稿）》主要对BsAb的临床研发应遵循的一般药物研发原则及规律进行概括。NMPA的指导原则主体内容介绍了BsAb的结构设计类型、机制类型和作用特点；在“确定合理的研发立题”部分，阐述了体现以临床价值为导向，以解决临床需求为目标的对BsAb研发立题的审评考量；在“临床研发中需要关注的问题”中，阐述了BsAb在临床试验风险控制、最佳给药策略的确定、临床试验设计、免疫原性、生物标志物开发等方面需特别关注的问题。
图6 中美关于双特异性抗体发布的指导原则
1）中美指导原则均为纲领性的文件，代表监管机构当前的要求，均对双特异性抗体的体外、非临床、临床试验提出策略性的指导。一些具体的研究方案还需要根据作用机制以及结构特征进行COU的设计。
2）由于双特异性抗体研发难度大、技术要求高，目前还在发展阶段。故中美指导原则对于试验设计、试验过程中的沟通均持开放的态度，欢迎申办企业积极与监管机构进行沟通。
3）对于体外试验、非临床试验以及临床试验数据，两个指导原则均要求高度重视。NMPA未给出评价要求，但FDA给出了药理学、毒理学和安全性评价的基本要求。二者对于临床药理学和药效学的要求保持一致。
4）二者对于双抗的分类方式不同。NMPA给出两种分类方式，即按照结构划分和按照作用机制划分，而FDA只按照作用机制进行划分。二者虽然都按照作用机制进行了分类，但分类结果也不同，NMPA的分类方式可能无法覆盖目前的研究领域，笔者认为FDA的分类方式可能更符合目前研发现状。
5）对于CMC的表征要求，NMPA并未在该指导原则中明确，FDA则明确了CMC阶段应根据标准单克隆抗体开发实践对产品进行表征，表征内容包括：抗原特异性、亲和性和开关率、亲和力（靶向同一细胞上两个分子的双特异性抗体）、效价、与产品相关的杂质（如聚集体、碎片、均二聚体和错配体）、稳定性和半衰期。
6）对于对照组的选择二者也是不同的。NMPA建议选择最优治疗方案作为对照，而FDA建议与标准护理或安慰剂进行对照。
7）关于PK浓度的检测，NMPA未做特别要求，FDA则给出检测基本要求，即检测游离、总量、以及不同结合态的浓度，同时指出可以采用一种以上的方法进行检测。
8）关于免疫原性部分，由于双特异性抗体结构的特殊性，两个指导原则均对免疫原性评估提出要求，其评估策略也基本一致。
9）关于生物标志物的开发，NMPA在正文中明确提出“可根据作用机制、靶点之间的生物学关系和临床意义（预测和预后价值等）进行生物标志物的设计，生物标志物的选择和使用”，结合CDE此前发布的《生物标志物在抗肿瘤药物临床研发中应用的技术指导原则》，可以最大化地发挥生物标志物在药物研发领域中的作用。
10）目前IgG样双特异性抗体具有丰富的组合形式，可以是单价1+1抗体，也包含1+2、2+2形式。同时BsAb同时桥接两个靶细胞可能形成两分子、三分子或多分子复合物。NMPA和FDA指导原则中的描述均未包含所有可能性。
药代动力学特性（PK）是指药物进入机体后在体内的吸收、分布、代谢以及排泄过程，PK研究在研发过程中对于药物的有效性和安全性评价非常重要。双特异性抗体药物在治疗方面表现出多种理想的特性，如溶解度大、选择性好和特异性好等。但是由于双特异性抗体药物结构组成、大小、理化特性、是否含有Fc以及靶点结合亲和力等多种因素均可以影响药物代谢动力学特性，故其PK特性比普通小分子药物或单抗药物更为复杂。一般情况下，双特异性抗体的药动学特征受结构影响较大，含有Fc区的IgG 样双特异性抗体与不含Fc区的双特异性抗体在药代特征上具有较大的差异。前者的药代特征是典型的单抗的药动学特征，后者的药动学特征类似于小分子。
图7 双特异性抗体的作用机制
通常，双特异性抗体药物评价PK方面的要求与抗体药物相同，但需要对其固有特性予以特殊考虑。一般采用单剂量和/或多剂量给药表征药物的PK特征（吸收、分布和消除）。但根据双特异性抗体药物的类型及其适应症，PK要求会有所不同。通常PK研究应贯穿临床试验的各阶段，逐步收集数据以充分描述产生药物效应（药效及临床安全性事件相关）的物质基础的特征。关于样本量，建议根据不同研究目的，结合产品特征，以可获得目标剂量下稳健的PK数据为基本原则，考虑纳入目标受试人群的例数。
在健康受试者研究中获得的PK结果，可外推到目标结果，但外推到目标人群时需进行论证。由于药物的消除在很大程度上取决于靶受体的摄取，采用健康受试者数据预测患者人群时应充分考虑健康受试者和目标患者人群之间的差异。
由于双特异性抗体在胃肠道的稳定性有限，通过肠壁的渗透性较差，双特异性抗体的口服生物利用度可以忽略。 因此，双特异性抗体通常通过肠外途径给药，包括皮下、静脉和肌肉给药。 直接给药到作用部位也被用来达到高的局部浓度，如玻璃体注射、腹腔注射和胸膜注射。
抗体在组织中的分布是通过组织外渗透率、组织内分布率、抗体在组织中的结合率和程度以及抗体在组织中的消除率来测量的。对于双特异性抗体来说，通过血管内皮细胞的扩散非常缓慢，对流被认为是抗体从血液到组织间质运输的主要机制。此外，通过对流运输的外渗速度，或通过“溶剂拖曳”抗体进入组织的速度，受血液到组织的液体流动速度以及血管内皮细胞旁孔分子筛效应的影响。抗体从组织中消除的速率主要通过对流消除和抗体在组织内分解代谢的速率来测量。
双特异性抗体的代谢发生在一系列组织和血浆中。通过药代动力学建模，皮肤，肌肉，肝脏和肠道组织对BsAb的消除均有贡献。通常，药物消除的机制包括滤过，分泌和生物转化。对于抗体药物在很大程度上可以通过分子量大小来预测消除途径。通常，蛋白质的分解代谢是经水作用发生。分子量 <69kDa的小蛋白通过肾脏滤过被消除，随着分子量降低，肾滤过作用越来越重要，随后被肾小管重吸收和次级代谢分解。对于双特异性抗体来说，它是可有可无的，因为它的大尺寸阻止了通过肾小球的有效滤过。对于分子量较大的蛋白药物，在水解作用之外，主要通过在其他组织和/或靶细胞中受体介导的内吞后再分解代谢进行消除。
双特异性抗体比单一特异性药物在研发合成、优化、药代动力学、安全性、生产、临床开发和商业化等方面更加复杂，双特异性抗体具有独特的结构结合域，多种治疗靶点和作用机制以及不同的存在形式，对分析方法、药代动力学和药效学的评估提出新挑战，同时增加了PK建模的复杂性。在药物研发的不同阶段，对双特异性抗体生物分析的要求也是不同的，可以选择检测完整的双特异性分子，也可以检测不同的功能分子。
在分析方法选择上，LC/MS、LC- HR-MS、LBA和流式细胞术仍然是广泛使用的生物分析工具，这取决于分子的结构、内源性物质干扰和基质中蛋白-蛋白相互作用的影响。LBA法因其高通量和高灵敏度的优势仍是目前生物分析的首选方法，在可预见的未来也将继续如此。配体结合分析法可用于生物样本中抗体的定量。但该检测方法存在局限性，包括对抗体片段的检测能力有限，开发时间长，选择性较差。LC-MS/MS已越来越多地用于表征生物治疗性蛋白质形态、识别宿主细胞污染物和量化药物药代动力学。LC-MS /MS的使用可能会更广泛地支持双特异性生物治疗药物的PK评估，尤其是用于完整蛋白质分析的（IC-）LC-HR-MS和CapillaryWestern blot技术拥有很大应用前景，因其可提供目标待测物的多维信息的能力（如分子量等电点和域功能）。LC-MS/MS与配体结合检测方法相比，具有方法开发时间更短、选择性更高、检测变异性小、可用性好等优点。再加上稳定的同位素标记的内肽和蛋白质标准物质，基本可以达到与LBAs相同的精密度和准确度。但是从监管的角度看，其在数据分析、解释和验证方面还需要进一步明确。
在方法特性考察上，双特异性分子的方法验证包括精密度和准确性、线性、选择性、特异性和对两个结合域进行干扰评价。在设计双特异性分子的生物分析方法时需要考虑的因素包括：生物样品，生物转化或体内不稳定性，空间位阻效应等。未来生物分析行业和监管机构对指导定量分析这些高度复杂的生物（蛋白）药的最佳做法的讨论和意见，将会极具指导意义。
药物的PK评价是通过测定血液循环中的不同形式的药物浓度来评价的，故可靠、稳健和可重复的PK分析方法对双特异性抗体药物的PK评价至关重要。但是由于双特异性抗体具有多个不同的结合位点和复杂的作用机制，这些为生物分析方法的设计带来了巨大的挑战。生物分析方法设计时需要综合考虑药物结构特点、靶点情况、作用机制和特征、技术可行性及监管要求等内容。
由于双特异性抗体在结构上具有不同的结合位点，BsAb在体内可能存在不同的形式，其活性的和非活性形式在方法策略制定时均需要考虑在内，并需要多种生物分析方法来满足不同形式药物的检测需求，包括：total, free, total bound, 以及partial bound，对不同分子形式的BsAb的检测分析需要按照“case by case”原则制定科学的检测策略。free的药物浓度对于PK更有意义，total的药物浓度对于TK更有意义，bound的药物浓度则跟药效更加相关。检测方面往往可以通过分析format的设计来达到检测free，bound或 total的目的。FDA关于双特异性抗体开发的指南[36]也指出：可能需要开发多种PK定量方法，以定量总（total），结合（bound）和未结合（unbound）的双特异性抗体的浓度，可能需要多种免疫原性分析来测量对不同BsAb域的免疫应答，至少检测完整的BsAb形式，即具有两个未结合位点的活性形式是必要的。
一般情况下，双特异性抗体的PK定量可以包括三个测定方法：一个双功能方法，即同时测定两个活性结合域（active binding domains）和两个单功能方法，即分别测定两个结合域中之一。当双特异性抗体药物在体外或体内稳定时，推荐检测完整的双抗分子。这种类型的检测目的是测量生物基质中完整的有活性的双特异性抗体分子，这些分子没有任何功能域被靶点或者ADA阻断。PK分析可以设计成三种不同的格式：双功能方法分别使用两个靶标蛋白作为捕获和检测试剂。单功能方法使用一个靶标蛋白作为捕获试剂，而使用抗人IgG作为检测试剂。考虑到BsAb的作用机制和结构复杂多变性，传统的桥联式分析可能无法提供检测的灵敏度和耐受性。在这种情况下，更多的分析格式和策略可以进行选择。除了分析format的设计，也可以通过特殊处理（如酸化处理）的方式来进行药物的检测。通过酸化的方式使得bound型的药物分子与靶点/抗药抗体的连接被打破，从而可以更加灵活的对total型药物进行检测。
图8 双特异性抗体PK浓度的生物分析策略[37]
在设计BsAb的分析时需要考虑的一些特殊因素包括：1）基质中双抗形态稳定性：一般可通过添加酶抑制剂或在冰上进行样品预处理可以解决稳定性的问题。2) 灵敏度要求：双抗临床给药剂量低，临床研究中经常需要一种灵敏的方法对目标物质进行测定(LLOQ通常为pg/mL水平)。3）避免潜在的空间位阻效应，如：一些双特异性分子靶向一个可溶分子和一个细胞结合分子(细胞表面受体)，然而双特异性分子和分析试剂在分析环境中可能有不同的相互作用，应考虑空间位阻效应。例如，检测平台可以通过选择特定的捕获和检测顺序，以避免不必要的位阻情况。4）与传统的单抗相比，双特异性抗体在体内表现出多样性和复杂性，分析方法需要考虑多个功能域的特征、生物转化或抗药抗体（ADA）对每个功能域形成的干扰，同时要求方法具有较高的特异性。
生物分析策略的选择在研发的不同阶段有不同的要求。对于非临床阶段，可以选择一种快速和经济有效的方法测定总药物水平，以支持整体毒理学评估。然而，这种方法不适用于临床试验，因为有更多的药物形式在体内发生作用，使用通用试剂与内源性分子的交叉反应会干扰游离药物浓度的测定，从而干扰PK/PD评估。
另一个非临床和临床生物分析策略的需要考虑的问题是：是否测量完整的双特异性抗体。在这方面，应重点考虑药物的作用机制，特别是在药效取决于双特异性对两个靶标的作用。如果药效依赖于完整的双特异性分子，测量完整的活性双特异性是充分表征分子的最佳策略；相反，如果药效依赖于一个靶标的参与，而第二个靶标的作用仅是增强药效，那么测量完整的药物可能就不那么重要了，在这一点上仅使用一种药物特异性试剂将是一个合理的策略。
案例分享1:
采用配体结合方法对双特异性抗体进行PK浓度分析[38]
FDA刚刚获批的VEGF：Ang2双特异性抗体Faricimab利用一对抗独特性抗体对，分别结合双抗的两个抗体结合域，实现对双抗浓度的检测。
图9 VA2 CrossMab的免疫分析示意图[38]注：VA2 CrossMab采用ELISA法进行定量。分析物的捕获是通过与VEGF抗体结合部位结合的生物素化抗独特型抗体完成的，使用第二个针对Ang2抗体结合部位的Dig标记的抗独特型抗体作为检测试剂，然后通过HRP标记的抗Dig抗体进行检测。
案例
分享2：
采用高分辨的液质
联用系统对双特异性抗体进行PK浓度分析[39]。
LC-MS/MS可以选择不同的特征肽段实现对双抗的检测，不同肽段检测结果的差别可以为分析抗体完整性提供支撑。
图10 LC-MS/MS方法总结及血浆中不同肽段的药时曲线图[39]
双特异性抗体的多域特性也使得潜在的免疫原性评估更加复杂。对一个结构域的免疫反应可以抑制特定功能[40]，同时保持其他结构域不变，潜在新表位的产生也可能导致显著的免疫原性。因此，研究双特异性抗体的免疫原性也可能需要开发多种检测方法来测量双特异性抗体不同域的免疫应答，免疫原性分析方法需要考虑更加复杂和全面。
由于抗药抗体主要是由外源成分或外源序列诱导的，因此对于含有较多外源或非自然序列的双特异性抗体来说，其免疫原性评估尤为重要[41]。基于结构、表位和柔性连接子的结构域特异性表征对于评估双特异性抗体的安全性和有效性也至关重要。FDA推荐的ADA评价从筛选到表征的分析流程同样适用于双特异性抗体[42]。在药物开发的不同阶段，对区域特异性ADA和中和(NAb)试验的需求可能不同。例如，对于非临床研究中毒性数据的解释，按照传统的总ADA的要求分为3层进行ADA试验就足够了。但在免疫原性的临床研究结果用于评估PK/PD的影响和治疗效果以及不良事件时,识别域和中和活性评估是至关重要的，那么至少需要一个NAb试验表明主治疗的作用机制是必需的[43]。大多数双特异性抗体是通过同时与两个细胞表面靶点结合的协同作用来达到其疗效的。因此，基于细胞的NAb检测对中和结合任何一个目标都是足够的。这可以通过酶标仪或流式细胞仪来进行分析。另外，带有报告基因作为测量终点的基因工程细胞系也可以被用于这一目的。
对于双特异性抗体的抗药抗体分析往往不能只停留在抗体本身的阶段。由于其结构和功能的特殊性，在免疫原性分析时需要从风险的角度出发，在产生针对全分子的抗药抗体后需要进一步分析抗药抗体所针对的结构域。具体的操作方式如下图所示。对于多结构域的抗药抗体分析往往是在传统免疫原性分析流程中通过加入特异性的结构域抑制以判断抗药抗体的结合位点特异性。
由于细胞因子风暴是双抗细胞桥接机制下最大的毒副作用，根据NMPA《药物免疫原性研究技术指导原则》应基于细胞因子释放机制设计合适的体外细胞因子释放试验。采用人全血或人外周血单个核细胞体外评价细胞活化和细胞因子的释放，可在一定程度上评估由双抗直接激活的细胞因子释放风险。
针对双特异性抗体的研发，NMPA明确提出可根据作用机制、靶点之间的生物学关系和临床意义（预测和预后价值等）进行生物标志物的设计、选择和使用。生物标志物的检测可广泛地应用于筛查、诊断、临床研究、指导用药、预后等领域。
生物标志物分析检测方法的验证重点在于其技术的可行性、灵敏度和特异度以及可重现性。
与其他大分子一样，双特异性抗体类药物的方法验证包括精密度和准确度，线性、稀释，选择性，干扰和特异性，以及稳定性考察，以确保其稳健性和数据完整性。然而，由于双特异性分子的性质，特异性和干扰评价是必要的。为了支持符合药物预期用途的PK数据的可靠性和有效性，监管机构要求对所有的GLP研究/关键临床试验，使用经过验证的分析方法来定量药物浓度。大部分监管机构对PK和免疫原性生物分析方法的验证提供了具体的指南
，这些指南在全球各监管机构中的要求普遍一致。
目前还没有利用LC-MS平台进行大分子生物分析的方法验证指南，这一主题的白皮书很少发表[44-46]。目前，普遍接受的LBA标准也可用于LC-MS检测。
双特异性抗体因其独特的结构、多疗靶点和作用机制，在多个治疗领域有着巨大的前景。但作为一种前沿技术，双特异性抗体在合成、规模化生产、质量分析控制、药代动力学、安全性、临床开发和商业化价值都面临着巨大挑战。随着众多临床研究的推进以及上下游工艺技术的进步，双特异性抗体项目不同效应机制逐步获得验证，规模化生产的障碍逐步得到解决，双特异性抗体有望为新型药物设计和开发提供新的发展机遇，预计双特异性、甚至多特异性生物疗法的数量和种类将继续增加，这也必将为患者提供更多的治疗选择。
来源：阳光德美
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