养正合剂质量标准提升研究

李锋博 * 冯煜付青青 2026-03-27

本文旨在建立科学、稳定的养正合剂质量控制标准，验证高效液相色谱 - 蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法测定其中黄芪甲苷含量的有效性与适用性。采用 HPLC-ELSD 法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱（Waters C18，4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈 - 水（32:68）为流动相，流速 1.0 ml/min，柱温 30℃，蒸发光散射检测器检测；通过系统适用性、线性关系、重复性、中间精密度、耐用性及准确度试验进行方法学验证，同时测定 15 批样品中黄芪甲苷含量，并与传统薄层扫描法（TLC）结果对比。结果显示，黄芪甲苷在 48 μg/ml ～ 387 μg/ml 范围内线性关系良好（r=0.997，n=6），重复性试验RSD=1.9%。得出的结论是该 HPLC-ELSD 法操作简便、准确可靠、重复性强，可有效排除杂质干扰，优于传统 TLC 法，适用于养正合剂的质量控制标准。

Part1 引言

养正合剂是由杨凌步长制药有限公司独家研发的国家专利药品（专利号：ZL201810876543.2），同时也是国家三类新药及国家医保乙类药品，已被《恶性肿瘤中医诊疗指南》列为化疗后气阴两虚证推荐用药 ^[1]。

养正合剂现行国家药品标准“WS3-000(Z-000)-2002(Z)”采用薄层扫描法（TLC）测定君药黄芪中黄芪甲苷的含量，但该方法存在分离效能有限、重复性与稳定性欠佳、检验效率低下以及展开剂毒性较大等问题 ^[2]。黄芪甲苷作为黄芪的核心有效成分，仅在 200 nm 紫外区呈现末端吸收特性，采用紫外 - 高效液相色谱法进行测定时易受到杂质干扰，导致检测准确性不足 ^[3]。而高效液相色谱 - 蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法作为一种通用型检测技术，适用于无紫外吸收或紫外吸收较弱的皂苷类成分，具有分辨率高、重复性好、操作简便快捷等优势 ^[4]，已成功应用于益气化瘀口服液、益心舒片、黄芪益气胶囊等多种中药制剂的质量控制 ^[5]。

本研究基于《中华人民共和国药典》2020 年版第一部的相关要求 ^[6]，采用 HPLC-ELSD 法测定养正合剂中黄芪甲苷的含量，并通过系统的方法学验证，旨在建立科学规范的质量标准，为养正合剂的质量控制标准提供可靠的科学依据。

Part2 材料与方法

2.1

仪器

试验所用仪器包括：Waters e2695+2424 高效液相色谱仪（含蒸发光散射检测器）；GL2202i-1SCN 百万分之一电子分析天平；H2Opro-UV-TOC 型超纯水器；R-300旋转蒸发仪。

2.2

试药

黄芪甲苷对照品（批号：110781-202219，纯度为96.2%）购自中国食品药品检定研究院（NIFDC）；甲醇、乙腈为 HPLC 级试剂；氨水、正丁醇、乙醇等均为分析纯试剂；D101 型大孔吸附树脂（内径 1.5 cm× 长12 cm）；养正合剂（批号：240501、240502，规格为10 ml/ 支）由杨凌步长制药有限公司提供，经检验均符合现行国家药品标准。

2.3

色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充柱（Waters C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）或等效色谱柱；流动相：乙腈 - 水（32:68）；流速：1.0 ml/min ；柱温：30℃ ；蒸发光散射检测器条件；进样量：10 μl ；理论板数按黄芪甲苷峰计算不低于 4000。

2.4

溶液制备

为建立黄芪甲苷的含量测定方法并考察专属性，分别制备对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液。

2.4.1

对照品溶液

精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每 1 ml 含 0.4842708 mg 的对照品溶液。

2.4.2

供试品溶液

精密量取养正合剂 20 ml，置 100 ml 分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取 3 次，每次 20 ml，合并正丁醇提取液；将提取液用氨试液洗涤 2 次，每次 20 ml，收集氨试液层，再用水饱和的正丁醇洗涤 2 次，每次10 ml，合并全部正丁醇液，置于旋转蒸发仪上减压回收至干；残渣加水 3 ～ 5 ml 溶解，通过 D101 型大孔吸附树脂柱，依次用水 50 ml、40% 乙醇溶液 30 ml 洗脱，弃去上述洗脱液，再用 70% 乙醇溶液 50 ml 洗脱，收集洗脱液，蒸干；残渣加甲醇溶解并定容至 5 ml，滤过，取续滤液，即得。

2.4.3

阴性对照品溶液

按养正合剂原方组成及制备工艺，去除黄芪药材，其余药材按比例称取，依法制备不含黄芪的阴性样品，再按“2.4.2”项下方法制备阴性对照品溶液，即得。

Part3 结果

3.1

系统适用性与专属

空白溶液及阴性对照品溶液在黄芪甲苷对应保留时间（约 22 min）处无干扰峰，表明方法专属性良好；对照品溶液连续进样 5 次的峰面积分别为 19876、20124、19987、20056、20102，RSD 为 1.5%（≤ 2.0%），理论板数为 19414（≥ 4000），符合系统适用性要求（见图 1）。

注：上图为供试品溶液；中图为阴性对照品溶液；下图为对照品溶液

图 1 黄芪甲苷色谱图

3.2

线性关系

精密吸取黄芪甲苷对照品溶液（C＝973.544 mg/ml）各 1 ml、5 ml、5 ml、5 ml，分别置于 20 ml、50 ml、20 ml、10 ml 的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。吸取上述线性溶液各 10 μL 注入液相色谱仪中，测定峰面积。回归方程为 Y=1.7588X+0.9304，相关系数 r=0.9999（n=5），表明黄芪甲苷在 48.6772 μg/ml ～ 973.544 μg/ml 范围内线性关系良好（见表 1）。

表 1 黄芪甲苷线性试验结果

3.3

重复性与中间精密度

取同一批号样品（批号：240501）同法制成 6 份供试品溶液，平均值为 0.066 mg/ml，RSD=1.9%（≤ 3.0%）；更换另一名检验员在不同的时间选取与重复性试验同一批号样品（批号：240501）同法制成 6 份供试品溶液，平均值为 0.070 mg/ml，RSD=1.0%（≤ 3.0%），表明方法重复性与中间精密度良好（见表 2）。

表 2 重复性与中间精密度试验结果（mg/ml）

3.4

耐用性

选择同一批号样品（批号：240501）同法制成供试品溶液，按“2.4.2”色谱条件测定供试品溶液中黄芪甲苷的含量。精密吸取供试品溶液各 10 μL，分别按照不同考察条件注入液相色谱仪中，记录色谱图。不同柱温、流速及色谱柱条件下，黄芪甲苷含量测定结果的 RSD 均≤ 3.0%，表明方法耐用性良好，适用于不同实验室及仪器条件下的检测（见表 3）。

表 3 耐用性试验结果（mg/ml）

3.5

准确度

制备 50%、100%、150% 三个不同浓度的黄芪甲苷对照品溶液，每个浓度制备 3 份供试品溶液，进行回收率测试，分别向样品中精密加入 50%、100%、150% 黄芪甲苷对照品溶液 3 ml、6 ml、9 ml，按照“2.4.2”供试品溶液制备方法，制成含 50%（C ＝ 70.592 μg/ml）、100%（C ＝ 141.187 μg/ml）、150%（C＝ 211.775 μg/ml）浓度黄芪甲苷的供试品溶液，精密吸取供试品溶液各 10 μL注入液相色谱仪中，记录色谱图，计算回收率，50%、100%、150% 浓度梯度的平均回收率分别为 90.1%、88.2%、83.4%，总平均回收率为 87.2%，RSD=2.8%（≤ 3.0%），表明方法准确度良好，可准确测定养正合剂中黄芪甲苷的含量（见表 4）。

表4 准确度试验结果

3.6

样品含量测定

取 15 批次养正合剂，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定黄芪甲苷含量；同时按现行国家药品标准中 TLC 法测定，对比两种方法的测定结果。15 批样品经 HPLC-ELSD 法测定，黄芪甲苷含量范围为 0.056 mg/ml ～ 0.088 mg/ml，平均含量为 0.070 mg/ml ；TLC 法测定平均含量为 0.057 mg/ml，HPLC-ELSD 法测定结果更能真实反映样品中黄芪甲苷的实际含量（见表 5）。

表 5 15 批样品黄芪甲苷含量测定结果（mg/ml）

Part4 讨论

养正合剂中黄芪作为君药，其核心有效成分黄芪甲苷具有增强免疫力、抗肿瘤、保护心血管等多种药理作用，其含量直接关系到药品的疗效与质量稳定性。本研究建立的 HPLC-ELSD 法，通过水饱和正丁醇萃取、氨试液洗涤及 D101 型大孔吸附树脂纯化等步骤，有效去除了制剂中水溶性色素、糖类、氨基酸等杂质的干扰，显著提高了测定的专属性与准确性。HPLC-ELSD 法操作简便、准确可靠、重复性强，优于传统 TLC 法，可作为养正合剂的质量控制标准。

未来可进一步优化养正合剂的质量标准：一是增加多指标成分含量测定，除黄芪甲苷外，可考虑同步测定制剂中君药红参的关键活性成分，如人参皂苷 Rg1、Re 等，构建更全面的质量控制体系；二是结合指纹图谱技术，建立养正合剂特征性色谱峰归属及相似度评价方法，以整体性控制反映生产工艺稳定性及批次间质量一致性^[7] ；三是注重科技发展和创新，加强评价方法研究，提升中成药标准的质量控制水平^[8]。

参考文献

[1] 中华中医药学会 . 恶性肿瘤中医诊疗指南 [M]. 北京：人民卫生出版社，2014：216-218.

[2] 王小明，赵满琼，叶向阳 . 养正合剂中黄芪甲苷含量的测定 [J]. 中国现代应用药学，2002，19(2)：144-145.

[3] 徐智，张友志，郭昌洪，等 . 益气化瘀口服液质量标准研究 [J]. 陕西中医，2019，40(9)：1285-1288.

[4] 王银，邱连建 . HPLC-ELSD 法同时测定益肺清化颗粒中的黄芪甲苷、桔梗皂苷 D 和麦冬皂苷 D 的含量 [J].天津药学，2018，30(5)：11-13.

[5] 姜锋卫，孙艳兰，高海燕 . 高效液相色谱法测定黄芪益气胶囊中黄芪甲苷的含量 [J]. 实验室检测，2025，3(19)：49-51.

[6] 国家药典委员会 . 中华人民共和国药典：2020 年版一部 [S]. 北京：中国医药科技出版社，2020：315.

[7] 孟宪生，罗曦，贾梦楠，等. 中药质量评价研究现状及“质-量”双标评价方法探讨 [J]. 中草药，2023，54(22)：7281-7286.

[8] 聂黎行，吴炎培，刘静，等 . 中成药质量标准研究有关问题思考 [J]. 药学学报，2023，58(8)：2260-2270.DOI:10.16438/j.0513-4870.2023-0337.

责任编辑：邵丽竹

审　　核：何发