药品微生物检验洁净室中常见环境菌的消毒效果研究

| 刘蓉赵晓冬王丹等 2025-06-03

通过对药品检验洁净室中常用的消毒剂进行效能验证，进而控制潜在的微生物污染风险。本研究采用悬液定量杀灭试验法，利用已知的标准菌株及从洁净区采集的已鉴定环境菌，对甲酚皂、新洁尔灭、75%乙醇和杀孢子剂等4种常见消毒剂的杀菌效果进行快速评估。结果显示，在各种消毒剂对菌株的杀灭效果中，当作用时间不同时，会呈现出显著的差异。75%乙醇和甲酚皂在作用时间较短时，对大多数细菌营养体杀灭对数值小于5，在延长作用时间后，效果有显著提高。新洁尔灭及杀孢子剂的杀菌效果在短时间内效果较好，尤其是对于葡萄球菌属和微球菌属，而芽孢对于各类消毒的敏感性均较低。在最长作用时间下，各消毒剂对营养体、芽孢及霉菌孢子的杀灭对数值均大于5。多种类的环境菌株更能全面反映洁净环境中真实的微生物污染状况，更有利于筛选合适消毒剂，进而为药品微生物检验机构及企业制定合理且有效的消毒程序提供依据。

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药品微生物洁净室是指专用于药品微生物检验的洁净实验室、隔离系统及其他受控环境，其洁净程度直接关系到药品检测结果的准确性。因此，定期对洁净实验室进行清洁消毒和微生物监控，使受控环境维持在可接受的污染风险水平十分重要^[1]。为保证消毒效果，需定期对消毒剂进行效力评估，这也是建立合理消毒规程的重要依据。消毒剂杀灭微生物的效力受到多种因素影响，如消毒剂的类型、浓度、与微生物的接触时间以及微生物的种类和生长状态等，这些因素的综合作用决定了消毒剂的实际杀灭效果。同时，各种菌株对不同消毒剂的耐受程度都有实际差异，在制定消毒剂管理程序时，应定期使用悬液法确认其有效性^[2]。本实验不仅采用了常规菌株作为实验对象，更创造性地加入了出现频率较高且长期适应于消杀环境的分离菌，选取消毒剂常用浓度，并设定不同的作用时间条件，以探究消毒剂在不同时间下的效果。

Part.01

试验材料

1.1

试剂与培养基

甲酚皂（山东利尔康医疗科技股份有限公司，批号： 20221229 ）；新洁尔灭（山东利尔康医疗科技股份有限公司，批号 20220902 ）； 75% 乙醇（山东利尔康医疗科技股份有限公司，批号： 20221103 ）；杀孢子剂（济南辰宇环保科技有限公司，批号： 20220824 ）；卵磷脂（国药集团化学试剂有限公司，批号： 20201216 ）；吐温 80 （国药集团化学试剂有限公司，批号：20190220 ）、硫代硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司，批号： 20200408 ），氯化钠（国药集团化学试剂有限公司，批号： 20220513 ）。胰酪大豆胨琼脂培养基（ TSA ，北京陆桥技术股份有限公司，批号： 221213 ）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（ SDA ，北京陆桥技术股份有限公司，批号： 230113 ）；芽孢染色液（北京陆桥技术股份有限公司，批号：230925 ）。

1.2

设备

HR30-IIA2 型生物安全柜（海尔生物医疗股份有限公司）； BF260/KB240 恒温培养箱（德国 Binder ）；SX-700 灭菌器（日本 Tomy ）。

1.3

测试菌株及来源

用于消毒剂效能验证测试菌株中的标准菌株（菌种编号： 1 、 9 、 10 、 11 、 12 、 13 、 14 ）均来自中国食品药品检定研究院，环境菌株来自本实验室 C 级和 D级区环境监测时采集的菌株（菌种编号： 2 、 3 、 4 、 5 、 6 、7 、 8 ）并已经过鉴定。

Part.02

方法

2.1

菌液制备

2.1.1 新鲜营养体悬液

取各菌种第 3 代新鲜培养物（ 24 h ），用 0.9% 无菌氯化钠溶液初步制成的菌悬液，可根据后续试验需要稀释成所需的浓度。

2.1.2 细菌芽孢悬液

取各菌种第 3 代的新鲜培养物（ 7 d ），当芽孢形成率达到适宜程度后，用 0.9% 无菌氯化钠溶液初步制成的芽孢悬液，于 60 ℃ 水浴中保温 30 min ，以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷却至室温后，可根据后续试验需要稀释成所需的浓度。

2.1.3 真菌孢子悬液

取菌种第 3 代的新鲜培养物（ 7d ），在斜面试管内加入 5.0 mL 含 0.05% （ mL/mL ）聚山梨酯 80 的 0.9%的无菌氯化钠溶液，反复吹吸洗下孢子，转移至灭菌试管中，可根据后续试验需要稀释成所需的浓度。

2.2

中和剂验证试验

选用不同成分的中和剂，对不同消毒剂品种进行中和处理， 75% 乙醇（ 0.1% 卵磷脂 +3% 吐温 80 ）、甲酚皂（甲酚含量为 3.0% ± 0.3% ， 0.1% 卵磷脂 +3% 吐温 80+0.5% 硫代硫酸钠）、新洁尔灭（苯扎溴铵含量为（ 30 ± 3 ）g/L ， 0.1% 卵磷脂 +1% 吐温 80 ）、杀孢子剂（过氧化氢4%~6.5% （ W/W ），银离子 ≤ 0.01% ， 1% 硫代硫酸钠）。

将菌悬液用 0.9% 无菌氯化钠溶液稀释成 10 2 ~10 3 CFU/mL ，作为实验菌悬液。实验共分 4 组：第 1组： 9 mL 中和剂 +1 mL 实验菌悬液 → 作用 10 min →吸取 1.0 mL 注皿；第 2 组： 1 mL 消毒剂 +8 mL 中和剂 +1 mL 实验菌悬液 → 作用 10 min → 吸取 1.0 mL注皿；第 3 组： 9 mL 稀释液 +1 mL 实验菌悬液 → 作用 10 min → 吸取 1.0 mL 注皿；第 4 组：阴性对照组：吸取 1.0 mL 稀释液注皿。每组平皿采用 TSA/SDA倾注法，在 37 ℃ /28 ℃ 恒温培养箱中培养（细菌繁殖体培养 48 h ，细菌芽孢及真菌需培养 72 h ），重复试验 3 次，活菌计数后求得每种实验菌的平均回收率。

2.3

悬液定量杀灭试验

实验组：在 9 mL 消毒剂中加入浓度约为 10 ⁸CFU/mL 的菌液，分别作用 1 、 2 、 5 min ，吸取 1 mL 混合液，置于 9 mL 相应的中和剂中，作用 10 min ，再吸取 1 mL 上述混合液，经适当稀释后活菌计数，操作方法同 “ 2.2 ”。

对照组：用 0.9% 无菌氯化钠溶液代替消毒液进行平行试验，作为阳性对照。每组试验重复 3 次，计算各组的活菌浓度（ CFU/mL ），并换算为对数值（ N ）。

2.4

评价规定

2.4.1 中和剂验证试验组

在达到设定消毒除菌作用时间后，应立即采用中和剂终止消毒进程以评估消毒除菌效果，参考《中国药典》 2025 年版四部 “ 药品微生物实验室消毒剂效力评估指导原则 ” 草案公示稿，对中和效果应进行验证。

中和剂的有效性：回收率 1= （第 2 组回收菌数 /第 3 组回收菌数） × 100% ，如回收率在 50%~200% 范围内，说明中和剂有效。

中和剂的安全性：回收率 2= （第 1 组回收菌数 /第 3 组回收菌数） × 100% ，如回收率在 50%~200%范围内，说明中和剂对挑战菌株的生长无影响。

2.4.2 悬液定量杀灭试验组

KL=No-N_x^[3]

其中：KL——杀灭对数值；No——对照组平均活菌浓度对数值；N_x——实验组平均活菌浓度对数值。

2.4.3 评价标准

各国评价标准有所不同，参考日本药典及美国药典的要求，计算试验菌在消毒处理前后减少的对数值：细菌或真菌营养体减少的对数值不少于 3，细菌芽孢或真菌孢子减少的对数值不少于 2，表明消毒剂对试验菌有效。

Part.03

结果

3.1

中和剂的验证结果

结果表明，各菌株的回收率均稳定在 50%~200% 的合理范围内。具体数据详见表 1~ 表 4 ，此浓度的中和剂展现出了良好的中和效果，能够有效中和本实验中所用的消毒剂，并且不影响菌株的正常生长状况。

表1 75%乙醇悬液定量杀灭试验结果

表2 甲酚皂悬液定量杀灭试验结果

表3 新洁尔灭悬液定量杀灭试验结果

表4 杀孢子剂悬液定量杀灭试验结果

3.2

各种消毒剂的悬液定量杀灭试验结果

本实验在活菌计数中因技术操作而引起的菌落数误差率均未超过 10% ^[4] 。在不同的作用时间下，各种消毒剂不同菌株的杀灭效力存在着一定的差异，但在延长作用时间后，均得到了较好的杀灭效果，由表 5 所示，可见消毒剂在一定的浓度下，对细菌的作用时间越长，消毒效果也越好^[5]。

表5 不同类型消毒剂的悬液定量杀灭试验结果比较

Part.04

讨论

4.1

消毒剂的选择

根据微生物杀灭对象的不同，消毒剂可分为杀孢子剂和非杀孢子剂（醇类、季铵盐类、酚类等），由于普通剂能够将微生物繁殖体减少到安全的水平，但不能杀灭孢子，因此本试验只在杀孢子剂的测试中增加了黑曲霉。

根据实验结果（表 5 ）可知， 75% 乙醇和甲酚皂在正常的作用时间下的杀菌效果稍逊于其他 2 种消毒剂，需要延长作用时间来得到更好的杀灭效果。真菌及芽孢杆菌对各种消毒剂的敏感性均相对较差。在所有被测试的消毒剂中，杀孢子剂对微生物的杀灭效力最强，其主要成分多为过氧化氢或过氧乙酸，它们作为强氧化剂，具有破坏或分解微生物细胞壁的能力，能够迅速进入细胞内，氧化细胞内的酶、RNA 和 DNA ，从而导致微生物死亡。

4.2

消毒剂的合理应用

根据微生物杀灭对象的不同，长期使用同一种消毒剂，很可能会造成微生物会逐渐产生抗性（即在一般可以杀灭或抑制绝大部分细菌的浓度下，具有消毒剂抗性的菌株则不能被杀灭或抑制^[6]），并加剧其抗性基因的传播风险，从而导致消毒效果降低^[7]。在 2020 版《中国药典》中，也提到了洁净区清洁和消毒的重要性，由于化学消毒方式有其不可替代性，因此所使用的消毒剂种类必须多于一种，以防止消毒剂抗性的产生和扩散，从而达到最大限度降低微生物污染的目的^[8]。

此外，根据真实的环境监测数据评估常用几种消毒剂的效能也十分必要。统计可知，在药品生产及检测环境中，葡萄球菌属及微球菌属在环境微生物中占比最高，主要来源于实验室的操作人员^[9]，其次为芽孢杆菌属。基于日常环境监测中对菌株的收集与鉴定数据，挑选出比较有代表性的菌株（例如细菌繁殖体、芽孢及真菌）用于消毒剂的验证试验，便可筛选出高效且适合的消毒剂。

同时，也要充分考虑各消毒剂的应用场景，醇类消毒剂特别适用于对精密设备和仪器的消毒工作，因为其不具有腐蚀性，不会对不锈钢和彩钢板等金属材质产生损害^[10]。而过氧化氢类消毒剂则因其无色无味无毒，对操作人员友好，具有广谱杀菌能力、高材料兼容性且性能稳定，常用于需要空间消毒的此类场景。除此之外，对人员、设备和房间的清洁消毒流程可以参考微生物调查的结果，优化相关程序，这样才能确保消毒剂能够达到预期的效果。

责任编辑：邵丽竹

审　　核：何发

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