虽然单特异性抗体长期以来一直是蛋白质疗法的基础，但抗体工程的最新进展使得开发更为复杂的抗体结构成为可能。新型分子形式 (NMF) 蛋白，例如双特异性抗体 (BsAb)，具有能够进行多特异性结合的结构，从而能够扩展治疗功能。随着对 NMF 蛋白的需求持续增长，生物制造商面临着提高生物反应器工艺生产率的同时保持产物质量稳定的挑战。当生产具有非对称模式的结构复杂蛋白质（例如 NMF）时，这一挑战更加严峻。本研究评估了高接种密度(HID) 补料分批工艺对两种表达独特 NMF（一种带有 Fc 融合蛋白的单特异性抗体和一种双特异性抗体）的 CHO 细胞系的生产率和产物质量的影响，并与低接种密度 (LID) 平台补料分批工艺进行了比较。研究发现，强化平台补料分批工艺在较短的培养时间内使两种独特结构复合蛋白质的产物浓度分别提高了 33% 和 109%，同时保持了与传统补料分批工艺相似的产物质量属性。

简介

在过去的几十年中，对蛋白质疗法的需求呈指数级增长；美国和欧洲批准的生物制药产品从 1989 年之前的 9 个跃升至 1990 年至 2009 年间的 184 个，仅在过去 13 年间就批准了303个。虽然单靶点单克隆抗体(mAb) 长期以来一直是蛋白质疗法的基石，但免疫疗法的最新进展推动了新型分子形式 (NMF) 蛋白的探索。NMF 蛋白通常可归类为复杂的蛋白质结构，通常由 IgG 片段或其他蛋白质部分组成，能够结合多个靶点。例子包括Fc 融合抗体、单链片段可变蛋白和双特异性抗体。NMF，尤其是双特异性抗体 (BsAb)，由于其能够同时与多个独特表位相互作用而显示出治疗多种疾病的潜力。由于其独特的结合能力，BsAb 提供了多种先进的相互作用机制，这是此前同型二聚体 mAb 无法实现的。目前，虽然只有 9 种双特异性蛋白获得 FDA 批准，但超过 100 种 BsAb 正处于不同的临床开发阶段，这突显了整个行业对 NMF 蛋白的兴趣日益浓厚。

随着对治疗性蛋白质的需求不断增长，生物制造商面临着一系列不断变化的挑战。首先，要实现大规模生产的经济可行性，需要高效的工艺，以提高蛋白质产量并降低商品成本 (CoG)。近年来，强化补料分批工艺因与传统补料分批工艺相比蛋白质产量大幅提高而备受关注。通常，这是通过高接种密度 (HID) 方法实现的，通常涉及灌流 N-1。灌流工艺利用细胞截留装置连续进料和废物清除来快速达到高细胞密度。高细胞密度灌流 N-1 培养物随后充当接种源，使接种密度远高于以前在生产规模上通过补料分批培养所能达到的水平。与传统的低接种密度 (LID) 补料分批工艺相比，强化补料分批工艺已报告产物浓度和时-空产率 (STY) 显著提高。例如，一些作者报告称，使用强化补料分批方法，STY和/或产物浓度提高了 70% 以上。使用强化补料分批工艺模型时，这些显著的产物产率提升已在传统 mAb 生产中得到广泛证实，因此已成为生物制造商中越来越流行的策略。

然而，虽然强化补料分批工艺已经为同型二聚体 mAb 的生产带来了变革，但对于通过单一重组工程细胞系在强化补料分批工艺中表达的 NMF，其类似优势尚未得到深入研究。一些作者报道，与 LID 补料分批培养相比，使用灌流生产生物反应器工艺可以提高 BsAb 的生产率。虽然灌流生产工艺确实有望提高生产率并降低CoG，但这种细胞培养方法尚未取代补料分批成为生物制造中最常用的工艺类型。此外，据作者所知，强化补料分批工艺在 NMF 生产方面的优势尚未得到广泛研究。

在补料分批培养生产 NMF 的过程中，需要克服的另一个障碍是众所周知的亚基组装过程中链配对不正确的风险。从生物制造商的角度来看，组装错误的链配对意味着错失生产正确产物的机会，并且有损净产量，甚至可能危及患者安全。幸运的是，CrossMAb™（Roche）和“Knob-into-Hole”等创新技术大大提高了正确链配对的比率，尽管理论上某些 NMF 结构仍然可能出现不良的副产物异构体或不完全配对。此外，据报道，NMF 经常具有大量不良产物质量 (PQ)属性，例如聚集、碎片化和分子特异性剪切。与 mAb 相比，许多 NMF 的结构更加复杂，这使一致产物的生物制造变得复杂，并有可能进一步降低蛋白质产量。此外，补料分批 HID 培养可能会带来自身的挑战，这可能会加剧 NMF 生产中观察到的产物质量障碍。随着蛋白质浓度的增加，蛋白质分子之间的相互作用也增加，从而降低了聚集的能量障碍。同样，HID 工艺中细胞的峰值浓度较高，导致收获时培养物中蛋白酶浓度可能增加，这反过来可能导致蛋白质碎片化。鉴于人们对复杂生物治疗分子的兴趣日益增长，以及强化补料分批工艺在大规模生产中的应用日益广泛，工艺强化对补料分批HID培养中NMF产物质量的影响仍然是一个重要且悬而未决的问题。本研究探讨了两种NMF蛋白（CrossMAb^™）的生产率和产物质量。我们对强化和传统补料分批工艺中两种技术形式的BsAb和Fc融合蛋白单克隆抗体进行了比较。我们证明，在HID培养中，两种NMF产物的蛋白质产量均有所提高，并且强化和非强化补料分批工艺之间的许多产物质量指标也相当。

详细的实验操作和结果，请参考原文。

图 1

NMF A 和 NMF B 产物图

图2

使用 FabALACTICA 进行 NMF B 处理的示意图

结果

LID 和 HID 生物反应器中的培养性能

LID NMF A 培养物在培养第10天至第12天达到活细胞浓度峰值，浓度分别为22.0和17.8×10⁶  cells/mL（图 3 a）。LID NMF A 培养物在第15天收获时的活细胞浓度分别达到18.4和15.0×10 ⁶ cells/mL。NMF B LID 培养物在培养第6天达到活细胞浓度峰值，分别为26.5和29.7×10 ⁶ cells/mL，随后浓度下降 ，直至培养第15天收获时分别 达到19.8和21.0×10 ⁶ cells/mL。在整个 15 天的过程中，两组 LID 培养物的培养活力百分比仍然很高，并且高于可接受的活力限度，收获时 LID 培养物中 NMF A 的活力高于 92.2%，而收获时 LID 培养物中 NMF B 的活力均高于 89.7%（图 3b）。

图3

a活细胞浓度；b活力；c LID和HID工艺中NMF A（空心圆和实心圆）和NMF B（空心方块和实心方块）的平均产物浓度。d NMF A（黑色实心条）和NMF B（灰色实心条）在HID培养和LID培养中产物浓度的平均提升百分比。e LID NMF A（灰色虚线条）、HID NMF A（黑色实心条）、LID NMF B（灰色条纹条）和HID NMF B（灰色实心条）的平均单位细胞生产力。误差线表示与平均值（n  = 2）的一个标准差。

在 HID 培养中，细胞浓度峰值出现得更高且更早，NMF A HID 培养在第 4 天达到最大浓度，NMF B HID 培养在第 4-5 天达到最大浓度。与 LID 培养类似，NMF A HID 培养测得的峰值活细胞浓度低于 NMF B 培养，NMF B 培养的最大浓度为 42.7-43.2 × 10 ⁶ cells/mL，而 NMF A 培养的最大 VCC 为 32.2-33.6 × 10 ⁶ cells/mL。与 LID 培养相比，NMF A 和 B 的 HID 培养在收获当天的细胞活力均有所下降；NMF A HID 培养在收获当天的细胞活力最低降至 81.3%，而 NMF B 在 HID 培养中达到的最低活力为 77.6%。所有 HID 培养均高于 HID 平台工艺可接受的活力限值。对于 NMF A 和 NMF B，在 HID 和 LID 工艺中，常用的废弃代谢物（乳酸、铵）浓度通常相似。除一种培养物（HID NMF B 第 12 天）外，所有培养物的收获日培养乳酸水平均保持在 3 g/L 以下。在一个 HID NMF B 培养物的第 12 天测得的 3 + g/L 乳酸浓度可能对培养性能影响甚微，因为收获细胞活力和产物浓度在生物学重复之间相似（图 3b、c）。对于 NMF A 和 NMF B，在 HID 和 LID 工艺中，收获日培养铵水平相似，介于 4.5 至 6 mM 之间。

HID 培养物的峰值 VCC 前移且升高反映了 HID 工艺目标，即减少 LID 培养物对数期生长所需的天数并快速启动细胞培养的生产阶段。这在产物浓度曲线中得到了证实，与 LID 培养物相比，HID 培养物中 NMF A 和 B 的产量增加且更早。LID 培养物在培养 15 天后分别达到 NMF A 和 B 的平均浓度 2.6 和 3.7 g/L，而 HID 培养物在 12 天内分别达到平均 5.3 和 4.9 g/L（图 3c）。对于 NMF A，这相当于产物浓度平均提升 109%（± 23.4%）；NMF A 的产物浓度平均提升从 LID 到 HID 培养物较低，约为 33%（± 0.45%）（图 3d）。此外，表达NMF A的HID培养物的平均单位细胞生产力（qP）比LID培养物高出约30%（图 3 e）。表达NMF B的LID培养物与HID培养物之间的平均qP差异可忽略不计（<1%）。

NMF A 产物质量比较

测量了从 HID 和 LID 培养物中收获的蛋白质的产物质量属性，以评估工艺强化对链配对/产物组装、聚集、纯度、电荷异构体特征和糖基化的影响。LID工艺规定在第 15 天收获产物，而 HID 工艺则在第 12 天收获。虽然培养时间相差三天可能会影响产物质量，但以收获日为单位的属性比较最能体现在生产规模下如何进行和分析这些工艺。

完整质谱 (MS) 分析证实，对于 LID 和 HID 培养物，收获的大多数产物都是正确配对的 NMF A 分子，每个测量强度的相对丰度分别为80.4% 和 71.5%（图 4a）。下表2显示了 NMF A 结构的图形表示，以及可以使用完整 MS 检测到的潜在错误配对的亚基和变体。在强化工艺培养中，缺少重链 Fc 融合蛋白的分子轻链变体的强度比例从平均14.5% 增加到 21.6%。在 LID 和 HID 培养物中均检测到极小比例的轻链片段。尺寸排阻色谱法显示 LID 和 HID 培养物中单体的百分比始终很高（图 4b）。检测到了一些聚集，随着工艺强化，平均百分比从 12.0 小幅增加到 15.4。检测到的片段水平可忽略不计，两个工艺的平均值均不超过 0.3%。还原和非还原纯度分析表明，LID 和 HID 工艺之间的纯度水平、亚基比例和完整 IgG 纯度大致相似，差异均不超过 1.5%（图 4c、d）。电荷异构体分析显示变化很小，主峰和酸性物质的比例下降了约 2%，而观察到的碱性物质的比例增加了 4%（图 4e）。在表达 NMF A 的 LID 和 HID 工艺之间，电荷异构体的排序没有变化，酸性物质的比例最高，其次是主峰和碱性物质。对两个工艺之间释放的 N-糖的分析显示，测得的糖型比例相似（图 4f）。与 LID 培养物相比，HID 培养物中 G0F 物质的比例增加，而 G0 物质的比例略有下降。

图4

在12天HID工艺（黑色实线）和15天LID工艺（灰色虚线）中表达NMF A的培养物的产物质量属性。a：NMF A亚基的相对丰度；b ：尺寸排阻；c：还原物种；d：非还原物种；e：电荷异构体；f： N-聚糖。误差线表示与平均值（n  = 2）的一个标准差。

NMF B 产物质量比较

测量了从 HID 和 LID 培养物中收获的蛋白质的产物质量属性，以评估工艺强化对链配对/产物组装、聚集、纯度、电荷异构体谱和糖基化的影响（如有）。收集了 HID 和 LID 培养物中最后一天的收获样品，并进行 PQ 分析，旨在最好地代表在生产规模下进行的比较。

对于表达NMF B的LID和HID培养物，结合FabALACTICA消化液，利用质谱仪进行链配对/产物组装分析。在表达NMF B的LID和HID培养物中，观察到表 3中（参考原文）所示的FabALACTICA消化后亚基的相对丰度水平相似。此外，在两个工艺中观察到的未鉴定峰水平也相似（图 5 a）。尺寸排阻分析显示，单体和聚集体种类的丰度与LID培养物相当，但HID培养物中观察到的单体种类约增加1%，聚集体种类约减少1%（图 5 b）。NMF B的低纯度分析发现，LID和HID培养物中均具有高纯度，且轻链(LC)、重链1(HC1)和重链2(HC2)的比例大致相似（图 5 c）。尽管NMF B具有两条独特的轻链，但本研究中使用的还原纯度分析方法灵敏度不足，无法区分本测定中的轻链。非还原纯度分析显示，LID和HID过程中的完整IgG水平较低，但相当，分别约为69%和71%（图 5 d）。有趣的是，电荷异构体分析发现，两种工艺之间物种异构体丰度的排序发生了变化（图 5 e）。在HID培养物中观察到主峰和碱性物种的比例更高，同时酸性物种水平下降。这导致排序发生了变化，与LID培养物相比，HID培养物中主峰物种取代酸性物种成为最丰富的物种。与 NMF A 的N-糖分析过程中观察到的变化类似，NMF B 在不同工艺中的糖型比较大致相似（图 5f），与 LID 培养物相比，表达 NMF B 的 HID 培养物的 G0F 物种水平略有增加，G0 物种水平略有下降。

图5

在12天HID工艺（灰色实线）和15天LID工艺（灰色条纹）中表达NMF B的培养物的产物质量属性。a：FabALACTICA消化的NMF B亚基的相对丰度；b ：尺寸排阻；c：还原物种；d：非还原物种；e：电荷异构体；f： N-聚糖。误差线表示与平均值（n  = 2）的一个标准差。

讨论

免疫疗法的最新进展重新激发了人们对双特异性抗体以及新型分子形式蛋白质的兴趣，因为它们比传统单克隆抗体具有更大的治疗潜力。为了满足日益增长的蛋白质治疗市场需求，许多生物制造商开发了高接种密度补料分批工艺，该工艺显著提高了时-空产量，并与低接种密度补料分批工艺相比保持了相似的产物质量属性。然而，强化补料分批工艺尚未在生产更复杂蛋白质方面得到全面评估。本研究评估并比较了在低接种密度 (LID) 和高接种密度 (HID) 平台工艺中培养的两种NMF的产量和产物质量属性。

HID培养旨在提高总体积生产率，主要通过在N生产生物反应器的整个生命周期内提高活细胞浓度来实现。在本评估中，表达NMF A的HID培养始终保持比LID培养更高的细胞密度（图 3 a）。表达NMF B的HID培养在除最后两天外的所有时间都保持比LID培养更高的细胞密度。与LID工艺相比，HID培养的NMF A和NMF B产物浓度平均分别提高了109%（± 23.4%）和32.6%（± 0.45%）（图 3 d）。NMF A和NMF B产物产量的提高与先前报道的在强化工艺中单克隆抗体生产过程中观察到的产量提升范围一致。所测试的两种NMF产物产量提升的差异可能是由于HID和LID培养之间单位细胞生产率的变化所致。在传统单抗生产过程中，工艺强化过程中qP的变化既有正向变化，也有负向变化。本研究中描述的HID工艺旨在主要通过持续提高VCC来提高生产率，而不会刻意影响单位细胞生产率。出乎意料的是，表达NMF A的LID和HID培养物的平均单位细胞生产率提高了30%（图 3e）。相比之下，表达NMF B的LID和HID培养物的平均单位细胞生产率下降幅度可忽略不计（约1%）（图3e）。虽然qP的变化可能直接受培养接种密度的影响，但qP的变化程度似乎取决于克隆，这一点可以从NMF A和NMF B 之间HID单位细胞生产率的差异中观察到。这一观察结果可能表明，某些克隆比其他克隆更“适合”某些工艺，尽管这一点尚未得到彻底研究。在工艺强化的背景下，解释单位细胞生产力差异的确切机制仍然未知，但在未来的研究中探索可能会富有成果。

在不同工艺之间，尤其是在生产复杂蛋白质的工艺中，保持产物质量属性的可比性至关重要。如果生产的蛋白质产物不符合既定的产物质量标准，不仅会对工艺的净产量产生负面影响，还会对患者构成潜在的安全风险。如前所述，NMF 由于其不对称设计，本身就可能带来额外的药效学 (PQ)挑战。链错配以及聚集、碎片化和剪切倾向的增加，是生产复杂蛋白质工艺中需要考虑的几个额外障碍。虽然许多潜在的药效学障碍在这些 NMF 之间是共通的，但本研究中评估的蛋白质产物之间独特的结构差异要求对其产物质量属性进行单独评估。例如，NMF A 是一种单特异性抗体，由于其与一条重链的 Fc 区融合，因此具有双重作用模式（图 1）。构成 NMF A Fab 区的两个臂完全相同，从而消除了链错配的风险。然而，Fc 融合蛋白的存在使得形成脱靶重链和轻链变体异构体成为可能。理论上，重链变体异构体包含与单个 IgG 分子上的两条重链结合的 Fc 融合蛋白，而轻链变体异构体不连接 Fc 融合蛋白。NMF B 属于传统的双特异性抗体类别，其变体轻链和重链对能够结合独特的表位。虽然 NMF B 的设计采用了“Knob-into-hole”和 CrossMAb ^™等技术，大大降低了链错配的风险，但作为生物制造商，出于尽职调查的需要，需要对产物链配对进行分析。以下段落分别研究了在工艺强化过程中观察到的每种 NMF 的产物质量属性变化。

在 LID 和 HID 工艺中，NMF A 培养物的许多产物质量属性评估结果相似。还原纯度、非还原纯度、电荷变体和N-糖分析结果在不同工艺中差异甚微，这表明工艺强化对 NMF A 的这些属性几乎没有影响（图 4 c-f）。然而，通过质谱仪进行的组装分析显示，在 LID 和 HID 培养物中，完全形成的 NMF A 的相对丰度下降了约 9%，而轻链变体的相对丰度则增加了约 7%（图 4 a）。NMF A 轻链变体的存在可能是由于一种称为“剪切”的现象，即与抗体融合的蛋白质部分被酶促从结构中切除。Fc 融合蛋白的剪切较为常见，据推测是由于蛋白酶活性和/或蛋白质折叠缺陷所致。HID 培养物中轻链变体 NMF A 物种丰度的增加可能部分归因于 HID 过程最后几天观察到的活力下降。有可能随着活细胞密度和活力从峰值下降，细胞内蛋白酶从垂死细胞中释放出来，从而剪切产物。此外，HID NMF A 培养物的尺寸排阻分析表明单体物种丰度略有下降，而聚集物种丰度略有增加。在复杂蛋白质的生产过程中，聚集现象也是一种有据可查的现象，强化工艺中产生的更高蛋白质浓度可能会增加产物聚集的可能性。在工业生物制造的背景下，虽然 Fc 融合蛋白的剪切和聚集增加当然是不可取的，但在强化补料分批工艺中观察到的 NMF A 的聚集和剪切水平可能足够小，以至于可以被生产率的大幅提高所抵消。

对于表达 NMF B 的 LID 和 HID 培养物，通过完整质谱仪分析链配对/产物组装证实，表达的大多数蛋白质异构体要么是完整的、正确配对的 BsAb，要么是轻链交换的不可能的理论同量异位素形成，完整性方法无法区分。然后进行 FabALACTICA 消化以确定已鉴定的大多数蛋白质异构体的链配对。FabALACTICA 消化旨在将抗体分解为三个亚种，如图 2所示，这可以更具体地识别和量化原始全抗体结构中存在的链对。对 FabALACTICA 消化后样品的分析显示，没有与具有 L1H2 或L2H1的理论 Fab 区亚基相对应的峰，这表明检测到的单体很可能是正确配对的变体（图 2、5 a）。出乎意料的是，在 LID 和 HID 工艺中均检测到了 缺乏轻链对的全长 H1H2 亚型（表 3 ），其相对丰度约为 8-9%（图5a）。FabALACTICA 消化后此类亚型的存在表明，在分析之前，抗体结构未能完全分离成三部分。此外，图 5a中汇总的多个未识别峰也支持了未完全消化的观点。然而，在这两个工艺中，汇总的未识别峰的百分比丰度远低于正确配对且完全消化的 NMF B 亚基。因此，鉴于 LID 和 HID 培养中正确配对亚基的百分比丰度一致，可以得出结论，工艺强化不会对 NMF B 的重链和轻链配对产生负面影响。非还原纯度分析的结果进一步支持了工艺强化没有产生负面影响，其中 LID 和 HID 工艺中完整 IgG 的比例在 1.5% 以内（图 5 d）。虽然两个工艺非常相似，但 NMF B 表现出高水平的碎片化，对完整物种的丰度和整个产物的理论产量产生了负面影响。双特异性抗体高碎片化水平的确切原因尚不清楚，可能因分子的结构和稳定性而异。先前的一项研究假设，用工程二硫键对双特异性分子进行化学还原会导致比以往在单特异性抗体生产过程中观察到的更高的碎片化水平 [ 28]。另一项研究发现，CHO 蛋白酶导致三种不同的 BsAb 发生碎片化和产物降解。在本研究中，LID 和 HID 工艺中同样高的碎片化水平表明，根本原因问题与工艺强化无关，而可能是 NMF B 在补料分批培养过程中的固有特性。电荷异构体分析过程中的排序变化可能表明 LID 和 HID 工艺之间存在翻译后修饰差异。唾液酸化、脱酰胺和其他几种翻译后修饰可导致酸性异构体的形成。对于 NMF B，LID 工艺中酸性物质的比例比 HID 工艺高出约 6%（图 5e）。翻译后修饰的差异会对产物功效产生不同程度的影响，并且可能取决于修饰的位置。在某些情况下，没有观察到任何影响。在其他情况下，分子的结合亲和力或效力受到影响。

本研究旨在探究补料分批强化生产工艺对表达两种独特NMF的CHO细胞系生产力和产物质量的影响。在LID和HID平台工艺中，分别对表达每种NMF的培养物进行重复培养。本研究产生的数据表明，通过补料分批强化生产NMF是提高生产力的可行策略。虽然在NMF A和NMF B的产物质量测量属性上观察到了一些差异，但这些差异常常被常见的PQ障碍所掩盖，这些障碍此前已在复合蛋白质生产过程中被报道过。其他研究人员报告称，通过在生产生物反应器中使用灌流技术，复合蛋白质的剪切和聚集减少。先前的一些研究假设，培养物中废物的持续清除、生物反应器蛋白质浓度的降低和/或内质网应激水平的改善是观察到的这些PQ属性改善的原因。相比之下，从细胞分泌到收获，补料分批工艺会积累废弃副产物，并且产物残留物在生物反应器环境中的浓度会不断增加。未来在研究复杂抗体生产过程中不同工艺的 PQ 差异的实验可能会发现，每个工艺持续时间内的样品时间过程可以突出显示产物质量属性（例如剪切和聚集）的动态（如果有）。我们的结果表明，补料分批工艺强化通常对生物制造过程中通常关注的许多产物质量属性影响较小。那些明显的负面因素，例如完全组装的 NMF A 相对丰度的降低（图 4a），其危害可能会因补料分批工艺强化带来的体积生产率的大幅提高而减轻。

原文：N.Q. Wolnick, M.R.Dickson, T.A.Webster, et al., Impact of fed-batch process intensification on the productivity and product quality of two CHO cell lines expressing unique novel molecular format proteins. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2024.