抗体偶联药物的偶联技术全面梳理

bob 2025-03-04

抗体偶联药物( antibody-drug conjugate，ADC)是一种将单克隆抗体药物的高特异性和小分子细胞毒药物的高活性相结合，用以提高肿瘤药物的靶向性、减少毒副作用的药物。和传统的抗体或抗体片段相比，ADC因为能在肿瘤组织内释放高活性的细胞毒素，因此理论上其疗效更高。

ADC从发展到现在已经经历了三个阶段的发展：

2000 年，第一个 ADC 药物 Mylotarg 获批上市，用于治疗急性髓系白血病。Mylotarg 作为第一代 ADC药物所用的抗体为鼠源抗体或者嵌合抗体，连接子不够稳定；因为采用非定点偶联，因此产品均一性较差。以上特点导致其药效较差，毒性/副作用较强，免疫原性强，半衰期较短等局限性。

第二代 ADC 药物包括 Adcetris (CD30) 和Kadcyla (HER2) 。第二代ADC药物在第一代的基础上进行改进，在抗体方面选择与抗原亲和力较好的抗体，减少与正常组织的交叉反应；并且选择嵌合/人源化抗体，减少免疫原性。在小分子毒物方面选择效果更好的MMAE，MMAF等小分子毒物。Linker为可降解和不可降解两种linker。与上一代ADC药物相比，具有更高的靶向性，较高的药效，较低的免疫原性。但是随机偶联技术仍会造成均一性较差的问题。同时还存在毒副作用较强，会出现耐药性，高DAR值导致药物被快速清除等问题。

第三代ADC在第二代的基础上继续改进，利用小分子毒物与人源单克隆抗体进行定点偶联，DAR值更均一，并且有多种差异化的小分子毒物可以选择。与前两代ADC相比，稳定性和药代动力学大大提高，药物活性更高，毒性更低。

抗体偶联物可以通过靶向天然氨基酸（1）来产生，包括链间二硫键（2），工程化的半胱氨酸（3），非天然氨基酸（4），碳水化合物部分（5），重链和轻链N末端（6）或工程标签（7）。强的蛋白质-蛋白质相互作用，即Fc结合结构域（FcBD）可用于形成非共价抗体偶联物（8）。另外核苷酸结合位点（NBS）可以作为抗体亲和标记的修饰位点（9）;可以利用具有催化活性的抗体（10）形成生物偶联物，其中抗体部分作为活性分子。

图片来源：Antibodies 2015, 4, 197-224; doi:10.3390/antib4030197

目前，偶联技术可分为2类：①利用抗体序列中天然的具备反应活性的氨基酸残基来介导的偶联技术，包括抗体表面赖氨酸的侧链氨基和链间二硫键还原后的巯基；②利用基因工程技术、化学修饰或酶修饰等在抗体特定位点引入可供反应的基团，再偶联载荷毒素，实现特定位点偶联，此类偶联包括工程化半胱氨酸定点偶联技术、非天然氨基酸定点偶联技术、酶介导的定点偶联技术、糖链介导的定点偶联技术等。

1赖氨酸的偶联

1.1传统赖氨酸残基非定点偶联技术

传统的赖氨酸偶联ADC药物采用非定点偶联技术，代表性药物有Kadcyla、Mylotarg、Besponsa。天然存在于赖氨酸侧链中的氨基，是与单抗偶联最方便的官能团，其不需要预先的化学修饰步骤。虽然由于其高的pKa(~10.5)，大部分蛋白质在中性pH下被质子化，但蛋白质中仍有一小部分氨基将以中性、未质子化的形式存在。赖氨酸侧链中的氨基在亲核性方面仅次于硫醇基团，但明显领先于其他的氨基酸的侧链(如精氨酸、丝氨酸、色氨酸、蛋氨酸)。然而由于赖氨酸的大量存在，有限数量的选择性偶联是非常具有挑战性的，因此赖氨酸偶联的ADC通常显示出广泛的DAR分布，例如lgG分子具有超过80个赖氨酸残基，其中溶剂可及性高的可偶联位点超过20个。

Kadcyla 结构

但是传统的赖氨酸偶联ADC药物采用非定点偶联技术，因此产品均一性较差，这种DAR与偶联位点的变化对临床效果产生不良影响。为了解决这个问题，科学家提出较多赖氨酸定点偶联技术，如选择性修饰活性最强的赖氨酸，通过酶实现定点修饰等。

1.2 pClick技术

pClick技术是无需抗体工程或复杂的反应条件的便捷方法。这种亲和肽方案由Han团队首创，他们选用来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的B结构域(FB蛋白)合成含非天然氨基酸的肽，由FB蛋白实现有利定位和接近，选择性非天然氨基酸与特定赖氨酸反应。当选用曲妥珠单抗(Tras)和FB-E25FPheK(4-氟苯基氨基甲酸酯赖氨酸)突变体作为模型底物时，研究人员证明过量的FB-E25FPheK突变体进行48 h的偶联反应可使Tras-FB偶联物的偶联产率>95%而单一修饰位点K337。

1.3 AJICAP技术

AJICAP技术是一类使用Fc(抗体可结晶片段)亲和试剂对天然抗体进行位点特异性修饰的方法。

第1代AJICAP利用Fc亲和肽试剂实现偶联后，用三(2-羧乙基)膦[tris (2-chloroethyl) phosphate，TCEP]还原以在特定赖氨酸上安装硫醇基团，而后用去氢抗坏血酸氧化重建因还原而裂解的抗体链间二硫键，由此成功地修饰了位点K248。

但再氧化步骤往往导致二硫键被扰乱与聚集性问题，所以第2代AJICAP避免了氧化还原处理，直接采用连接子裂解反应，除与K248成功偶联外，使用具有适当间隔子的恰当Fc亲和肽试剂还能合成与K288偶联的ADC。

1.4邻近诱导技术

Rajagopalan团队发现，抗体的轻链与重链之间存在着高度保守的核苷酸结合域(nucleotide binding domain，NBD)，这种存在于所有免疫球蛋白Fab(抗原结合片段)组的特性为其广泛的应用创造了可能。通过建模分析与计算机筛选，Bilgicer团队确定IBA对该NBD有高亲和力，Kd(dissociation constant)值范围为1~8μmol·L⁻¹，具体取决于抗体。于是他们设计了依靠IBA偶联抗体核苷酸结合位点的紫外光交联方法，并发现在紫外光不至损伤抗体活性的情况下最多能实现1.41个偶联。

为了避免紫外光对抗体的影响，Lam团队对亲和试剂进行了优化。他们发现带负电荷的氨基酸可增强对NBD的亲和力和交联能力，于是采用OBOC组合肽库和新颖的筛选策略确定亲和元素天冬氨酸和丝氨酸残基(DS肽)，再结合1,5-二氟-2,4-二硝基苯以实现对核苷酸结合位点的不可逆连接。

1.5 关键点定向修饰技术(linchpin-directed modification)

关键点定向修饰技术是Rai团队首创的，他们通过可逆的分子间反应将“关键点”放置在所有可及的特定氨基酸残基上，再使另一官能团不可逆地选择性修饰邻近的特定基团，最后解离关键修饰，完成对蛋白质的特异性修饰。其中，他们使用间隔子调整以精确匹配邻近修饰的相对方向。最初，研究人员设想通过关键修饰高丰度的赖氨酸来实现对低丰度氨基酸的特异性修饰，并成功获得了选择性良好、对肿瘤细胞抑制效果好的DAR 4的ADC。但这样的策略很难在复杂混合物中精确修饰单个蛋白质，于是研究人员设想通过关键修饰半胱氨酸实现对邻近赖氨酸特异性修饰(LDM_C–K)。他们首先用TCEP处理单克隆抗体以减少二硫醚并引入游离半胱氨酸，再利用LDM_C–K技术得到定点修饰的醛抗体偶联物(antibody-aldehyde conjugate，AAC)，用美登素DM1的羟胺衍生物处理得到ADC。

1.6赖氨酸特异性试剂

Bernardes等人也报道了特定部位的赖氨酸酰化反应。使用从计算机辅助预测的具有最低pKA的抗体赖氨酸的试剂，在略碱性pH的酰化反应将在动力学上有利的。研究发现磺酰基丙烯酸酯仅使用单摩尔当量(37℃，pH 8.0)就能快速进行反应，使得曲妥珠单抗轻链Lys207的定量和不可逆修饰，并完全保留天然二级结构和功能。

1.7 K-lock

Concortis Biosystems 公司(现为Sorrento Therapeutics)报道了一种名为K-lock的一步赖氨酸结合技术，该技术可以通过将细胞毒性有效载荷连接到预先选择的抗体位点来产生位点特定的ADC。尽管该技术的细节尚未披露，但已经被用于各种项目，例如，与 Lova Therapeutics合作的靶向5T4的 ADC药物（ZV05）。

2与半胱氨酸的偶联

天然存在于半胱氨酸侧链中的巯基(-SH)是ADC领域中最普遍的反应之一，主要基于三个元素。(A) 巯基是最亲核的氨基酸侧链官能团(比胺更亲核)；(B)抗体中适合结合的链间半胱氨酸的数量相对较少(对于IgG1和IgG4为8个)，并且对抗体的稳定性不重要，这使得相对可控制的DAR成为可能；(C)链间半胱氨酸，存在于铰链区，连接重链(HC)和轻链(LC)，在连接后可以‘隐藏’疏水有效载荷。目前基本上硫醇偶联 ADC 均基于马来酰亚胺化学。已经开发了多种马来酰亚胺类试剂用于烷基化，烷基化发生在天然链间半胱氨酸或工程半胱氨酸上。

2.1链间二硫化物还原和烷基化技术

链间二硫化物还原和烷基化技术最初由Willner等提出，作为避免与赖氨酸偶联产生的异质性问题的便捷替代方法。单抗中的半胱氨酸都参与了二硫键的形成，因此需要在与LD结合之前进行还原步骤以释放硫醇基团。通过优化还原剂（通常为TCEP或DTT）的量，以释放特定的自由硫醇基团(对于IgG1和IgG4，最多释放8个)。目前全球上市的17个ADC中，有13个ADC是通过与半胱氨酸偶联制备的，例如Adcetris、Polivy、Padcev、Enhertu、Blenrep、Trodelvy、Zynlonta、RC48等。由于缺乏位点特异性，这些ADC通常以随机混合物的形式产生，包含0/2/4/6/8等不同偶联率的组分，平均DAR在2.3-4之间。然而，有两个例外，Enhertu和Trodelvy是通过所有链间半胱氨酸的接近定量水平结合产生的，DAR分别为7.7和7.6，因此具有位点特异性。

（1）马来酰亚胺烷基化试剂

马来酰亚胺（MC）因其高选择性、快速反应动力学和温和的反应条件而广泛适用于通过迈克尔加成反应与抗体的硫醇基团偶联。

基于马来酰亚胺试剂与半胱氨酸烷基化

即便如此，这些 ADC 中产生的硫代琥珀酰亚胺键在存在含硫醇物质的情况下是不稳定的，因为它可以通过逆迈克尔反应断裂或与HSA和GSH等内源性硫醇交换，导致药效学、药代动力学和安全性不理想。在 7-14 天内，血浆中含有硫代琥珀酰亚胺的 ADC 的有效载荷脱落率高达 50-75%。

最理想的方式是制备开环的MC，但MC基团反应性较弱，难以实现，已报道的制备稳定开环产物的方法主要是利用马来酰亚胺-硫醇反应生成硫代琥珀酰亚胺，然后诱导其水解。通常需要在马来酰亚胺附近引入额外的催化基团，在MC底物中嵌入6个PEG单元后水解速率大幅增加。

Seagen通过使用DPR技术，在烷基链的a位上带有氨甲基，解决了此问题。在加入硫醇后，氨基诱导琥珀酰亚胺结合物的自发自水解，从而阻止了逆Michael反应。

MC水解需要在特定的碱性缓冲液中（例如pH为9）条件下对ADC进行长时间的处理来实现；然而，这可能导致蛋白质降解事件，例如脱酰胺或焦谷氨酸的形成。

（2）其他半胱氨酸烷基化试剂

各种替代马来酰亚胺烷基化的技术近年来也被开发出来。N-甲基-N’-苯基乙烯磺酰氨试剂就是一个很好的例子，其结构中具有能与巯基良好反应的双键，所形成的硫醚键很难发生类逆Michael反应而断开。

由于甲磺酰基苯并噻唑(MSBT)是一种选择性的硫醇封闭剂，Barbaset等人开发了一系列芳香族甲磺酸试剂，用于硫醇蛋白质的烷基化反应。类似地，甲磺酸基嘧啶与硫醇通过亲核芳香取代机理进行反应。

Glythera（现为 Iksuda）的研究人员报告了通过将游离半胱氨酸硫醇基团与 4-乙烯基吡啶反应获得的高度稳定的硫醚 ADC，这种技术称为PermaLinks。所得 ADC 具有被证明具有良好的稳定性。

柏林大学开发的亚膦酸膦技术，现在已被Tubulis商业化使用，其与传统的马来酰亚胺相比，具有缺电子三键的芳基膦酰亚胺化合物显示出极好的半胱氨酸选择反应活性，同时所得到的(Z)-乙烯基硫醚具有极好的稳定性。

2.2 链间二硫键桥接技术

二硫键桥接技术于1990年被Smith and Lawton研究团队开发，该方法可以在不影响抗体天然结构的前提下进行定点偶联。其主要分为以下4个步骤：（1）还原二硫键并得到两个具有活性的半胱氨酸；（2）载荷中的再连接试剂和其中一个半胱氨酸发生反应；（3）剩余的一个半胱氨酸和上一步生成的半胱氨酸-再连接试剂复合物发生反应，从而生成新的连接。

双马来酰亚胺或双马来酰胺酸烷基化/交联化

马来酰亚胺烷基化的能力也被应用于各种交联双马来酰亚胺试剂。每个试剂将捕获两个游离的半胱氨酸硫醇基团，从而在所有八个链间二硫键完全还原后导致DAR4 ADC。例如，New Bio 的 NBT828 中使用了双马来酰亚胺交联剂。

双溴甲基试剂的烷基化/交联反应

通过还原链间二硫化物，然后与双溴甲基芳基试剂反应，例如双溴甲基喹恶啉，发生不可逆交联制得硫醚。

二溴并氮杂二酮的烷基化/交联化

Chudasamaa等人开发了一种基于氮杂二酮(PD)基团的核心结构的的重桥技术。与马来酰亚胺衍生物不同，氮杂二酮环更稳定，不会通过水解开环，从而得到更均匀的共轭化合物。研究者开发了一溴PD(MBPD)和二溴PD (DBPD)的衍生物，并证明了这两种衍生物都能够在pH 8.0的条件下与硫醇基团发生特异性反应。

二乙烯基嘧啶

2019年Walsh等人利用含有两个Michael 受体的二乙烯基嘧啶与还原后的二硫键反应，并且具有较高的偶联得率。但是因为该试剂中桥接二硫键的链较长（中间跨越7个碳原子），因此反应中存在二硫化物加扰。

β-sulfone的烷基化/交联反应

游离硫醇的高亲核性和简便易行的Michael加成也被用于不同类型的交联剂中，最初被Del Rosario和Wilbur报道，并由Poly-Therics (现为Abzena；THIObridge技术)为ADC开发。重桥可以通过使用双硫醇反应基团重新连接形成的硫醇来增加还原抗体的稳定性，从而更好地保持最终连接物中的构象完整性。用由双-a,a-甲苯磺酰基甲基酮前体原位形成的α-甲苯磺酰基甲基-α,β-不饱和酮试剂处理还原抗体会导致一系列反应，例如，Michael加成，β-消除甲苯基亚磺酸，并再次Michael加成以提供稳定的交联产物。

目前已经有很多基于链间二硫键桥接技术与天然抗体的二硫键进行特异性偶联的ADC药物处于不同的临床阶段，但是链间二硫键桥接技术目前还存在很多限制和陷阱。首先，偶联过程中二硫化物的加扰不可避免，这在一定程度影响产品的功效、产量和放大生产。Felix F. Schumacher等人研究发现通过链间二硫键桥接技术制备ADC时容易产生半抗结构，他们采用原位偶联的方式可以很好控制偶联位点的特异性，解决了产生半抗的问题。

2.3 THIOMAB技术及其衍生方法

THIOMAB的定点偶联技术是由来自于Genentech的Junutula及其同事发明的。THIOMAB技术是与半胱氨酸的偶联中的经典方法，它证明了药物抗体定点偶联的可行性和益处，并衍生出一系列由工程半胱氨酸实现的定点偶联技术。该技术中主要是引入了一个额外的半光氨酸，在还原性条件下，引入的半胱氨酸及链间的二硫键被还原，在CuSO4或者去氢抗坏血酸的作用下氧化并再次形成二硫键，而药物最终通过马来酰亚胺化学反应偶联到额外引入的半胱氨酸上。THIOMAB的定点偶联技术ADC药物的DAR值由额外引入的半胱氨酸决定。研究者利用该技术将MMAE和抗MUC16的抗体偶联，并在卵巢癌动物模型中取得了更好的疗效。更重要的是，该药物在提升疗效的同时具有更高的剂量耐受性并提高了药物在大鼠和猴血清中的稳定性。此外，该方法还被证明能有效实现与高效且具有广泛活性的吡咯并苯二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepines，PBD)偶联，而传统方法难以实现。

一系列研究的开展优化了THIOMAB技术。例如位点的调整能防止在抗体Fab间产生多余的二硫键；选择带正电的环境能促进水解，从而提高药物的稳定性。又如优化马来酰亚胺基能减少逆迈克尔反应的产生，从而防止细胞毒性药物从抗体中过早释放。

THIOMAB技术的成功使许多工程半胱氨酸相关的方法应运而生。Dimasi团队尝试在有利的突变位点前后插入半胱氨酸，还原氧化后与有效载荷特异性偶联，但引入额外的半胱氨酸可能会使二硫键错配。Shiraishi团队则提出在暴露较少的位点诱变引入半胱氨酸，这样能直接与药物分子偶联而避免复杂的还原氧化工序，但前期需要对合适位点进行大量筛选。

这些技术已被用于开发具体药物，一种研究比较完善的药物是SGN-CD33A (Vadastuxi-mab-Talinine)。该药物使用THIOMAB技术偶联PBD二聚体，DAR约为1.9，能有效靶向并使白血病细胞周期停滞和凋亡，显示出抗白血病活性。在临床评价中，该药物作为单药，在白血病患者中表现出活性和可耐受的安全性，完全缓解率为28%；大多数不良事件与骨髓抑制一致，非血液系统不良事件包括疲劳、恶心和腹泻。（未完待续）

3 糖基化偶联

IgG型抗体中存在两个保守的糖基化位点N297，该位点位于CH2结构域，远离抗体结合抗原的功能结构域，因此利用该位点进行偶联不会对抗体的结合功能造成影响。

糖基化定点偶联技术几个优点：

（1）所有天然IgG抗体N297位都含有高度保守的糖基化位点，且该位点远离抗原结合位点，相比于随机偶联技术，糖基化偶联不影响ADC的结合和内吞。

（2）偶联位置均为N297位，偶联位点确定，均一性好，低免疫原性。

（3）天然的糖苷键在血液循环中是稳定的，PK更好，代谢稳定性好，安全性提高，药效提升。

（4）糖基化定点偶联，如下图所示，疏水性小分子的药物隐藏在Fc的口袋空腔里面，遮挡了载荷的疏水性，并减少了可裂解连接子的暴露，可能增加了ADC的整体水溶性，并减少了循环过程中载荷的过早释放。因此“Hide-Inside“这种策略非常有利于ADC体内的稳定性和活性，也可以屏蔽一部分免疫毒性，提高安全性，提升潜在治疗指数。

ADC的糖基化偶联技术不改变抗体的结构，无需进行抗体工程化改造、不引入非天然氨基酸和特定的氨基酸序列突变以便进行偶联。目前可用Fc端糖基化偶联技术有：糖基氧化的修饰、糖代谢工程、酶工程等。总的来说，利用该糖位点的偶联，主要是通过在糖基上引入一个新的反应基团，然后再利用相关试剂进行定点偶联。

3.1 基于糖基氧化的修饰

Fc端糖基的核心可以通过选择性高碘酸盐氧化修饰，然后与酰肼毒素小分子反应，形成具有完整免疫反应性的腙连接缀合物。这个技术早在gemtuzumab ozogamicin开发的时候就曾使用过，但抗体的敏感性导致了在氧化过程中抗体活性的损失，所以才采用的AcBut连接子的赖氨酸随机偶联技术。

3.2 代谢工程化修饰抗体寡糖

Okeley等人通过代谢工程修饰抗体寡糖，在细胞培养基中掺入岩藻糖类似物6-硫代过乙酸盐，以这种方式在糖基的核心处引入巯基，巯基可以作为使用马来酰亚胺化学连接连接子-载荷的锚定点。

3.3酶工程化修饰抗体寡糖

利用糖基转移酶，主要是通过在糖基上引入一个新的反应基团，然后再利用相关试剂进行定点偶联。目前拥有酶工程糖基化偶联技术的公司也有多家，包括Syniffix，康宁杰瑞和糖岭生物等，但是具体使用的酶和linker接头均有所不同。

双酶法

Synaffix公司创建的GlycoConnect™技术，包括用EndoS修剪Fc糖链，随后转移GalNAz或叠氮-半乳糖基团，以及最终点击连接子-载荷。结合多种连接子-载荷选项，这项技术已被多家合作公司用来生成DAR 2的均质gsADC。

赛诺菲酶研发中心一项研究中，抗体首先通过半乳糖转移酶（GalT）和唾液酸转移酶（SalT）顺序修饰，形成相对均质的唾液酸化抗体，然后被氧化形成醛基，最后通过氧化酮缩合与载荷偶联。但是这一过程已被证明可以诱导蛋氨酸氧化，从而影响FcRn的结合。

美国佐治亚大学的恶李等人首次在半乳糖化后使用SalT将叠氮功能化的唾液酸引入Fc糖链，然后通过应变促进的叠氮-炔烃环加成（SPAAC）与二苯环辛炔（DBCO）功能化的连接子-载荷偶联，并且唾液酸的修饰并未影响FcγRIIIa的结合。

来自美国国家癌症研究所的朱等人利用工程化的GalT（GalT-Y289L）增强转移活性，将2-酮半乳糖引入已被半乳糖苷酶脱半乳糖的Fc N-糖链末端。随后，通过氧化酮缩合反应引入连接子-载荷。

糖合酶是内-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺酶（ENGase，一组内切糖苷酶）的突变体。链球菌的ENGase EndoS或M49血清型的EndoS2在两个GlcNAc的几糖核心之间切割Fc N-糖链。之后，叠氮、环丙烯或降冰片基标记的唾液酸化全长糖链在活性的氧唑啉格式下可以被EndoS-D233Q或EndoS2-D184M通过生物正交反应整块转移到GlcNAc-抗体上。由于EndoS、EndoS2或它们的突变体对Fc糖链具有高度选择性，它们催化的酶促糖链重塑仅限于Fc糖基化，保留Fab糖链完整。

单酶法

中国科学院上海药物研究所黄蔚教授团队利用EndoS2的同时去糖基化/转糖基化活性，建立了一单酶法糖基化偶联技术，其中去糖基化和将叠氮二糖转移到去糖基化抗体在同一个反应系统中同时发生，仅用一种酶。由于二糖对EndoS2来说是一种非天然底物，由于糖链修饰的截短，叠氮功能化抗体的转糖基化产物对酶的水解具有高度抵抗力。叠氮抗体随后可以通过SPAAC与DBCO-连接子-载荷偶联，产生位点特异性gsADC。这种整洁的方法显示了对GlycoConnect™ Synaffix技术的明显领先优势，因为它将两个酶两步反应减少到单酶一锅重塑。根据设计linker的不同，黄蔚老师的文章中有一酶一步和一酶两步的策略。

4工程化抗体的位点特异性生物偶联

4.1酶介导的偶联

酶介导的位点特异性反应能提供几乎确定的DAR 与偶联位点，是一种有前途的合成均质 ADC的方法，在近年来蓬勃发展。这种方法利用酶的精确定位能力和低脱靶率，在下一代抗体药物偶联中显示出巨大潜力。

谷氨酰胺转氨酶(TGase)

TGase 可以通过共价结合赖氨酸和谷氨酰胺残基侧链，主要通过催化谷氨酰胺-羧酰胺基团和赖氨酸-氨基之间异肽键的形成，形成分子间和分子内蛋白质交联复合物。在适当的条件下，TGase也可以用来选择性地将赖氨酸功能化的LD或其他具有末端氨基的LD连接到抗体中谷氨酰胺残基的侧链羧胺基团上。需要注意的是，单抗中的天然谷氨酰胺通常不是天然TGase的底物。目前已经采用了各种策略来实现异肽键的形成。

Schibli团队首先用糖苷酶 [Peptide-N4- (N-acetyl-beta-glucosaminyl) asparagine amidase F，PNGase F] 去除 N-糖链，然后用谷氨酰胺转氨酰胺酶处理，使Q295处形成异肽键以实现偶联；又对 N297Q 突变体进行谷氨酰胺转酶处理产生在Q295和Q297 处修饰的产物，此法所得 ADC 的 DAR 为 4.0。

Schibli 团队还合作研发了利用 2步策略合成均相 ADC 的方法。首先除去糖链，使偶联位点Q295 被微生物谷氨酰胺转氨酶特异性识别，并且将含有叠氮化物的连接子连接到抗体上。然后，MMAE 通过 SPAAC 连接到抗体上。此法所得 ADC 的 DAR 为 2.0，可以特异性识别HER2 并有效杀死癌细胞。

2017年，Anami等人报道了一系列适合作为mTG介导偶联的酰基受体底物的支链叠氮化物接头。每个接头含有两个叠氮基团，通过mTG介导的偶联连接到N297A突变型抗HER2抗体上。这便于通过SPAAC连接Val-Cit MMAF单元，产生的ADC平均偶联率DAR为3.9。

另一方面，Ebenig等人为了避免去除糖链可能导致的抗体稳定性问题，他们在曲妥珠单抗的C末端融合了一种新型识别标签SPI7G，该标签源自天然微生物谷氨酰胺转氨酶底物链霉菌木瓜蛋白酶抑制剂。利用微生物谷氨酰胺转氨酶的识别能力，他们通过SPAAC反应成功地将MMAE与曲妥珠单抗相连。研究显示，这种标记方法非常有效，制备的ADC的DAR值为1.81，具有靶向杀死SK-BR-3乳腺癌细胞的能力，其IC50值为151pmol·L−1。此外，他们还发现合成肽SPI7G（P2）以及基于SPIP的肽在转化率上表现出色，超过80%。在生物素化实验中，改造后的抗体trastuzumab-SPI7G（Ab2）显示出比LLQG标签的抗体更快的偶联效率。值得注意的是，使用新识别基序构建的ADC在SK-BR-3肿瘤细胞上展现出更高的荷载-抗体比率和更强的效力。

转肽酶（Sortase）

该方法依赖于转肽酶的催化特性。转肽酶A（Sortase A）可以识别LPXTG （X表示任意一种氨基酸）氨基酸序列，将T-G肽键切割，并连接含oligo-G的分子。利用Sortase A的这个特性，可以在oligo-G上连接各种类型的分子，来实现与抗体特定位点的偶联。这个方法已经用于产生ADC，例如，NBE Therapeutics公司利用这一方法，通过将LPETG标签融合到重链C-末端，然后与五甘氨酸修饰的细胞毒有效载荷PNU-159,682连接，开发了已经进入临床的ADCs 药物NBE-002。同样，GeneQuantum开发了基于重链 C 端 LPGTG 的GQ-1001药物。

甲酰甘氨酸生成酶（FGE）

Aaron等人探索了一种新的利用醛标记蛋白质的位点特异性偶联。该技术利用了基因编码的五肽序列（Cys-X-Pro-X-Arg），其中半胱氨酸残基被FGE识别，并在细胞中蛋白质表达期间被共翻译氧化为甲酰甘氨酸。这样，工程化抗体通过HIPS（hydrazino-Pictet–Spengler）化学方法与醛特异性连接子选择性偶联。Redwood Bioscience 公司的专利 SMARTag ™技术即采用 FGE来实现抗体与药物的定点偶联。

类异戊二烯转移酶

LegoChemBio 利用类异戊二烯转移酶技术开发ADC。在抗体 C 端插入由几个甘氨酸序列连接的CAAX 序列，利用类异戊二烯转移酶将异戊二烯基连接在 CAAX 序列的半胱氨酸残基上，再与连接子发生肟连接反应，从而实现抗体药物定点偶联。

酪氨酸酶

另一个新兴的新方法是通过酪氨酸标签进行位点特异性抗体标记，酪氨酸标签与单克隆抗体轻链的C末端基因融合。考虑到位点可及性，Bruins及其同事使用了一种工程化的四甘氨酰酪氨酸残基作为标记，它为偶联提供了一个容易触及的位点。酪氨酸酶将酪氨酸氧化成1,2-醌，从而允许与各种双环[6.10]壬炔（BCN）衍生物的环加成反应。这种方法可以与含有BCN连接子的MMAE有效地偶联。

磷酸鞘酸基转移酶 (phosphatidylinositol transferase，PPTase)

PPTase 是一种催化 4′-磷酸嘀呤基辅因子 (P-pant) 从辅酶 (coenzyme A，CoA) 与酰基载体蛋白 (acyl carrier protein， ACP) 或肽基载体蛋白(peptidyl carrier protein，PCP) 内高度保守的丝氨酸残基共价连接的酶，具有异常广泛的底物耐受性，这为位点选择性修饰蛋白质提供可能。

目前主要使用的 PPTase 主要是来自枯草芽孢杆菌的 Sfp 和来自大肠杆菌的 AcpS，由于作为识别标签的PCP和ACP结构体积过大，已被Walsh 团队凭借噬菌体选择优化为 11 个残基长度的 ybbR 序列 (Sfp)以及12个残基长度的 S6(Sfp)和 A1(AcpS) 序列。

Grünewald 等发明并比较了 PPTase 介导的位点特异性 ADC 合成的一步和两步偶联策略，他们发现两步偶联策略因第一步中具有小生物正交基团的 CoA 类似物与未修饰的 CoA-SH 相似大幅提高了偶联效率，使整体产率更高，且能灵活调控连接子长度和化学成分。这种两步偶联的策略是在抗体中引入优化的肽标签，由泛酸前体分子制备具有小的生物正交手柄的 CoA 类似物，在ATP(腺苷三磷酸) 存在下由 PPTase 催化使两者位点特异性偶联。再用生物正交化学反应完成与大体积药物分子的偶联。

微管蛋白-酪氨酸连接酶 (tubulin-tyrosine ligase,TTL)

TTL 是一种在微管稳态中起重要作用的酶，可重新利用以将酪氨酸衍生物添加到任何在 C 端携带 Tub-tag (VDSVEGEGEEEGEE) 的蛋白质上。TTL 还被证明有宽泛的底物耐受性，不只有酪氨酸衍生物，还有一些与酪氨酸结构无关的氨基酸，这为 TTL 介导的标记提供了更多可能。Schumacher 团队首先证明了TTL的有效性与巨大潜力，他们将 Tub-tag 引入纳米抗体的C 末端，在TTL介导下与3-N3-酪氨酸偶联，产率高达 99%，再通过生物正交化学反应即可实现定点偶联。此后，他们提出多种 Tub-tag 蛋白质修饰方案，详细阐述如何使用 TTL 通过一步和两步程序修饰蛋白质，探索 TTL 的多种应用。在最近的研究中,他们将 Tub-tag 融合到CD30 mAb 轻链的C末端，在 TTL 的介导下与连接子为 VC-PAB 的有效载荷 MMAE 进行定点偶联，产生了DAR 2 的均质 ADC，称为Tub-010。该 ADC 被证明具有类似于 Adcetris 的结合亲和力、内化效果、溶酶体释放特征、体外细胞毒性功效和旁观者活性；由于 MMAE 的疏水性被 Tub-tag 肽提供的亲水性抵消，Tub-010 比Adcetris 聚集减少了 5 倍；在特定情况下，Tub-010 较 Adcetris 对肿瘤控制效果更好且治疗窗口更宽。

合成酶 (SpyLigase)

Fierer 团队将化脓性链球菌的纤连蛋白结合蛋白的 CnaB2 结构域设计并遗传分裂为 3 个实体，分别名SpyTag(AHIVMVDAYKPTK)，KTag(ATHIKFSKR D) 和SpyLigase，其中 SpyLigase 是能够指导 SpyTag 和 KTag 这 2 种肽之间形成肽键的酶。Zakeri 等将这种技术运用于药物偶联中。他们将 SpyTa融合到IgG1 抗体 Fc 结构域的 C 末端，又使 KTag 在其 N 末端连接 MMAE，在适当反应条件下利用 SpyLigase 将功能化的 KTag 偶联到抗体的 SpyTag 上。研究人员通过HIC和DAR 分析反应测得 KTag 与细胞毒性有效载荷以点击化学连接时的 DAR 能高达 1.76；SEC 分析显示肽标记抗体没有显著聚集行为。该 ADC 被证明反应靶向性强；使用可裂解连接子时 IC50 为0.1 nmol·L−1，体外效力强。此外，所使用的肽标签放置在蛋白质的内部位点时也具有反应性，DAR 有望更高。

最近发表了一种类似于 SpyLigase 介导的连接方法，称为 SnoopLigase 介导的连接，已被用于纳米抗体的设计生成，有望进一步用于 ADC 的定点偶联。

硫辛酸连接酶 (lipoate-acid ligase，LplA)

LplA 能催化硫辛酸及其非天然底物结构偶联到高度特异性的 LplA 受体肽标签(GFEIDKVWYDLD A)，这提供了位点特异性偶联的思路。Alabi 团队首次证明了 LplA 在抗体偶联物处理中的潜力，他们通过蛋白质工程将LplA 受体肽标签掺入曲妥珠单抗的重链中，并通过微生物谷氨酰胺转氨酶和 LplA 的组合以一锅化学酶偶联的方式产生位点特异性双标记的抗体-荧光偶联物。

这之后，Yamazaki 团队试图应用 LplA 来创建无标签修饰的定点偶联技术。研究人员先通过实验分析，得出即使在无标签修饰的情况下，LplA 具有“偏倚”位点特异性且抗体中赖氨酸的修饰独立于溶剂暴露性。于是他们在 ATP存在下用 LplA催化8-叠氮-辛酸与抗体“偏倚”位点特异性偶联再通过生物正交化学反应与有效载荷偶联,得到完整ADC。检测到反应对pH 依赖性不强；酶修饰的副产物腺苷单磷酸和腺苷二磷酸对反应效率没有显著影响。

捕捉标记 (SNAP-tag)

SNAP 标签是人类 DNA 修复酶的改造版本，通过将 O(6)-苄基鸟嘌呤修饰的分子的烷基不可逆地转移到半胱氨酸残基上实现定点偶联。这种反应简单且快速，选择性高，产品均一性高。Barth 团队先制备抗体 SNAP 标签融合蛋白，再将 O(6)-苄基鸟嘌呤修饰的MMAE偶联到纯化的融合蛋白上，得到目标产物。

尽管许多酶促偶联方法已成功应用于合成均质 ADC，但仍存在一些需要高酶浓度和高效应分子当量或很难产生更高 DAR 的方法。此外，这些方法的一个潜在缺点是插入的标签序列可能在人体中是免疫原性的。因此，在产品开发过程中，需要对生成的 ADC 进行完善的免疫原性评估以确保其安全性。

4.2 引入非天然氨基酸的定点偶联

天然氨基酸中目前可用于偶联的氨基酸只有赖氨酸和半胱氨酸，非天然氨基酸可被构建到重组蛋白中，获得可与小分子药物发生化学反应的残基侧链。因此非天然氨基酸为 ADC 的开发提供了一个新的技术手段。通过非天然氨基酸可以实现抗体-药物位点特异性偶联。蛋白质在核糖体上的合成通过 tRNA反密码子与 mRNA 密码子识别来进行。Ambrx 公司引入可特异性识别非天然氨基酸的 tRNA 和与之相对应的氨酰 tRNA 合成酶，在氨酰 tRNA 合成酶的作用下，tRNA 与对应的非天然氨基酸结合形成氨酰 tRNA，再通过其反密码子与 mRNA 上的密码子互补，使非天然氨基酸被整合到多肽链中，合成含非天然氨基酸的重组抗体。引入的非天然氨基酸通常为乙酰苯丙氨酸(1)、叠氮基甲基-L-苯基丙氨酸(2)和叠氮赖氨酸(3)。非天然氨基酸上带有的酮基、叠氮基官能团可与药物连接子发生化学反应，获得 DAR 均一的 ADC。酮基可与羟胺基团形成肟键，叠氮基团可与炔基在铜的催化下形成 1，2，3-三唑的环加成反应，叠氮基团还可以在没有铜催化的情况下与环辛炔结合，发生叠氮-辛炔环加成反应。引入非天然氨基酸的抗体与药物连接子可定点、定量偶联，获得 DAR 均一、药效高、稳定性好、安全性高的ADC，但也存在抗体表达困难，易产生免疫原性的弊端。Ambrx公司的ARX788 是首个利用非天然氨基酸开发的抗体偶联药物，目前处于临床研究阶段。

4.3其他工程化抗体偶联技术

硒代半胱氨酸

硒代半胱氨酸与半胱氨酸非常相似，区别是氨基酸结构中的一个硫原子被替换为了硒原子。在酸性条件(pH 5.2)下，硒代半胱氨酸比半胱氨酸更容易与亲电试剂发生反应。因此抗体可在弱酸性和还原条件下进行偶联，而无需将抗体再氧化。这种在抗体中插入硒代半胱氨酸，获得的工程化抗体被称为“selenomabs”，可以实现在不改变该抗体完整结构的情况下进行区域特异性偶联的目的。

丝氨酸代半胱氨酸

Mc Donagh 等开发了丝氨酸代半胱氨酸的方法来实现定点偶联。打开链间二硫键后，利用丝氨酸取代 4 或 6 个链间半胱氨酸，将反应性半胱氨酸的数量减少到 4 或 2 个，从而生成均一的 ADC。

THIOMAB技术及其衍生方法

5 其他偶联技术

赖氨酸与半胱氨酸作为广泛使用的靶标，在化学反应方面具有显著优势。然而，异质性问题对其药效性质产生了负面影响，进而影响毒性表现。为了应对这一难题，Reddy团队报道了基于内源性氨基酸的化学替代方法。其中，因酪氨酸、色氨酸、组氨酸的芳香族侧链表现出独特的反应性和选择性，多种基于芳香族侧链改性的化学技术应运而生。

蛋氨酸

酪氨酸

蛋氨酸是一种主要负责保护人体免受氧化应激的氨基酸。因此，与其他氨基酸残基相比，其功能化不太可能损害蛋白质的功能。另一个优势是蛋氨酸的丰度较低(约1.8%)，这降低了特定标记的概率。针对蛋氨酸也有了合适的化学修饰方法，称为ReACT方法。2017年，Lin等人报道了在一系列生物相容反应条件下，通过氧化还原化学选择性标记恶氮杂环类试剂，然后点击化学连接有效载荷，实现了高选择性、快速和稳健的蛋氨酸标记。该技术适用于鉴定整个蛋白质组中的高活性蛋氨酸，也可用于产生ADC，例如选择性结合到工程化的曲妥珠单抗Fab片段上的C-末端蛋氨酸标签。2018年，Taylor等人还报道了一种C末端工程蛋氨酸的选择性反应，该反应基于高价碘试剂的亲电反应性，以及蛋氨酸的侧链SMe基团具有完全化学选择性的点击化学。尽管在概念上两者都非常优雅，但发现所得蛋氨酸偶联物的稳定性一般，需要进一步优化才能成功应用于ADC 领域。

广泛的双正交标记策略是基于酪氨酸(Tyr)的苯酚侧链上的选择性化学。酪氨酸出现在蛋白质序列的频率中等 (自然丰度为3.3%)，从而为其独特的苯酚侧链的位点选择性标记提供了机会。尽管酪氨酸通常部分埋藏在蛋白质表面，但它也可以参与氢键，并且由于其氧化还原潜力，可以形成酪氨酸自由基，使电子转移。因此，酪氨酸残基经历了高度多样化的生物修饰，如硝化、氧化、交联、AMP化、卤化或糖基化。

Bruinset等人报道了一种最新的方法，该方法基于从特殊设计的酪氨酸部分生成1，2-苯二酮衍生物，然后通过无金属点击环加成的环辛炔环(BCN)来形成稳定的环辛烯键。通过使用mushroom酪氨酸酶选择性地氧化可溶于溶剂的酪氨酸，在抗体表面生成1，2-苯二酮基。

组氨酸

组氨酸是另一种相对较低的天然丰度(2.9%)和低内在亲核性的氨基酸，因此有可能成为一种潜在的适合于抗体位点特异性结合的氨基酸。2017年，Sijbrandi引入了一种新的抗体偶联方法，使用基于阳离子有机铂的连接子随机连接抗体的组氨酸，以稳定地连接LD。基于铂的连接子的结合导致ADC具有不受影响的抗体结合活性，DAR在2.5-2.7范围内，并且大约85%的有效载荷结合到Fc区域。