在无菌药物生产中，确保治疗产品的长期稳定性至关重要。某些活性药物成分 (API) 与水或有机溶剂结合时可能会形成不稳定溶液。因此，需要使用适当的干燥方法开发粉末形式的 API/产品，从而延长存储时间。冻干，也称为冷冻干燥，是一种科学程序，其中将混合物冷冻并置于真空环境中后从中去除水分。这种方法有利于固体（冰）直接转化为蒸汽状态而不经过液相，这种转变也称为升华。冻干包括三个独立而又相互关联的阶段：冷冻、初级干燥和二级干燥。冻干是一种广泛使用的干燥技术，主要用于稳定大分子，特别是生物制剂，如蛋白质和肽疗法。生物制剂比小分子药物具有更大的复杂性和敏感性，因此在其生产过程中，尤其是在冻干工艺中，需要仔细考虑。这是由于其独特的属性，包括聚集、吸附和生物活性。

目前，美国食品药品管理局 (FDA) 和欧洲药品管理局 (EMA) 批准名单上的大约 50% 的生物药物都采用该技术作为生产程序。这是因为冻干可以阻止或减少固态药物引起的物理和化学恶化，从而提高长期稳定性。超过 30 % 获得 FDA 批准的肠外药物是冻干产品。如国际协调会议 (ICH) Q8(R2) 所述，药品开发的目标是生产高质量的产品，而其生产工艺则旨在始终如一地提供所需的产品性能。然而，FDA 的药品生产评估办公室 (OPMA) 表明，冻干注射产品的应用通常会偏离 ICH Q8(R2) 中提出的推荐参数。冻干工艺需要大量的时间和能源资源。在冻干循环设计中使用反复试验的方法可能会导致生产费用增加。因此，优化每个阶段的冻干工艺对于建立高效且有弹性的冻干循环至关重要。2014 年，FDA 还发布了关于肠外产品冻干的指南。设备设计和能力对于将冻干制剂从小规模成功转移到大规模生产或其他工业设施至关重要。图 1展示了注射剂冻干工艺的决策树。本综述以注射剂冻干为主题，探讨了制剂中使用的不同赋形剂以及 QbD 原则在冻干中的应用。我们还从监管方法的角度讨论了生产过程中的各种挑战。本文的主要目的是从行业和监管的角度为制剂科学家提供对冻干工艺、其应用、挑战和可能的解决方案的全面理解。

图 1. 冻干：肠外制剂的决策树。

制剂开发

制剂组成在冻干产品生产中至关重要，因为它可能会影响冻干的许多阶段，例如储存和复溶。重要因素包括灌装量和赋形剂的组成和百分比，因为这些可能会影响最终产品的稳定性、复溶所需的时间和水分含量的百分比。制剂科学家在开发冻干治疗产品之前应考虑以下因素。

溶剂选择

水是冻干工艺中主要使用的溶剂。然而，一些 API 可能存在溶解度问题，在暴露于水环境时会发生水解分解。因此，在这种情况下，单独使用有机溶剂或与水混合使用是有利的，特别是在提高 API 稳定性和溶解度方面。该溶剂体系具有以下优点：(a) 加快升华速度；(b) 提高溶液的化学稳定性；(c) 增强最终产品的物理和化学稳定性；(d) 通过微生物抑制特性提高溶液的无菌性。然而，使用有机共溶剂体系可能存在几个问题，如毒性、安全性、操作挑战、储存以及最终产品中允许的残留溶剂量。在冻干制剂中使用有机溶剂时，必须考虑残留溶剂。允许的溶剂水平必须远低于美国药典（第 <467> 章）和 ICH Q3C建议的每日暴露限值。

溶解度

在不同 pH 和温度条件下测量 API 饱和溶解度可为冻干前溶液中 API 浓度提供重要数据。所选的本体溶液中的 API 浓度必须低于特定温度和 pH 条件下的 API 饱和溶解度。饼状物对周围环境中水蒸气通过的阻力可能取决于溶质含量。更准确地说，溶质浓度的增加会导致产品阻力增大、温度升高和质量流量减少。可以观察到冻干产品的结构变化，例如饼状物微塌陷、塌陷和收缩。通常建议药物制剂经过冻干，固体含量应低于 20%。

溶液稳定性

评估 API 溶液在不同环境下的稳定性至关重要，包括室温和 2–8 °C，含或不含赋形剂。该评估应在 pH 范围 3–9 和 24–48 小时范围内进行。该评估旨在检测可能源自 API 的任何可能的降解产物。在溶液的生产过程中，本体溶液通常保存 24–48 小时，包括过滤、灌装和装入小瓶。建议在进行冻干工艺之前确定本体溶液保存期的持续时间和温度。

灌装量

考虑灌装量对于实现高效冻干至关重要，通常建议灌装量最多为小瓶容量的 35–50%。这有助于减少真空去除后的产品损失，并有助于增大冷冻过程中形成的冰晶。冻干饼的阻力会导致玻璃小瓶中的灌装量增加，从而提高饼高，影响干燥时间。冷冻时间与灌装量成正比。仿制冻干药品的灌装量是通过在开发过程中将其形式与参考产品进行比较来确定的。为了实现完全冷冻，如果灌装深度 ≤ 1 cm 和 > 1 cm，则应将最终冷冻温度（通常为 −40 °C）分别设置为 1 小时和2 小时。应避免灌装深度 > 2 cm，如果做不到，则相应增加冷冻时间。

冻干制剂中使用的赋形剂

选择合适的赋形剂并达到理想的浓度仍然是开发冻干产品的一大难题。赋形剂的选择对于改善冻干饼的外观、长期稳定性和复溶时的张力至关重要。我们将简要介绍冻干产品中使用的赋形剂，如表 1所示。

表1. 冻干制剂中使用的赋形剂。

冻干循环开发

创建冻干产品的第一步是确定制剂的玻璃化转变温度 (Tg) 和塌陷温度 (Tc)。这是因为它可使初级干燥在这些温度以下进行，从而防止冻干后回融或塌陷。低温显微镜和差示扫描量热法 (DSC) 是常用的测定 Tg 和Tc 的技术。由于初级干燥温度占循环时间的一半以上，因此它是最重要的冻干参数之一。这两种热分析都有助于确定该温度。开发冻干循环的阶段如图 2所示。冻干的一般步骤（根据作者的实践，图 2）从确定 Tg 和 Tc 开始。一般而言，目标Tc 通常比 Tg 高 1-3°C；然而，在某些情况下，差异可能更显著。可以将主要干燥温度设定为低于所获得的 Tc 值。通过一次改变工艺参数的一个因素或利用 QbD 方法优化该循环后，文献综述在这方面会有所帮助。可以通过改变参数来执行最终优化的循环稳健性研究，以获得稳健的循环，从而提高对冻干产品的信心。

图2. 进行冻干循环开发的指南或步骤。

冻干工艺

冻干工艺已成为众多研究的主题，是克服制剂不稳定性的一种可能方法。下一节包括冻干工艺（图 3）。在开发冻干循环之前，科学家应该彻底了解冻干工艺。

图 3. [A]冻干工艺概述；[B] 冻干中试工厂示意图；[C] 冻干循环示意图。

冷冻

冷冻阶段使样品处于低于共晶温度或安全冷冻温度。温度范围通常在 −40 至 −60 °C 之间，而在特定应用中可能低至 −60 至 −80 °C。冷冻也可以独立进行，这与干燥过程不同。此阶段对于确定冰的形状和孔径分布非常重要。该过程可导致两种可能的结果：液体在特定温度下快速凝固（共晶形成）和液体转变为逐渐更粘稠的状态而不凝固（玻璃形成）。可以采用热分析来增强对其固有特性的理解，以确保产品适当冷冻。差示扫描量热法 (DSC) 和冷冻显微镜是经常使用的热分析方法。一旦确定了产品的凝固点，确定最佳冷冻速率就至关重要。冷冻发生的速率是决定所得晶体大小的一个决定性因素。需牢记的是，产品中的冷冻液体会随着时间的推移而升华。因此，较低的冷冻速度将产生更显著的晶体结构，从而使产品更具多孔性，从而可以更快地干燥。通常，这种做法有利于优化冷冻干燥循环；此外，在补水或复溶方面，它可能会产生不太理想的产品。相反，快速冷冻速度会产生加速失活和更小的晶体结构。因此，这会产生更颗粒状的外观，尽管延长了冷冻干燥时间，但仍易于复溶。Tang 和 Pickle 报道了无定形产品冷冻过程的一些关键点，这些点有助于建立稳健的冻干循环：（a）将装载的小瓶在 5 °C 下保持0.25-0.5 小时；（b）降温至 −5 °C 并保持 0.25-0.5 小时而不结冰；（c）以约1℃/min的速率冷冻至−40℃；（d）当灌装深度≤1cm时保持1小时，当灌装深度>1cm时保持2小时。

冻结过程中产生的应力

冷冻条件对于冻干来说至关重要；然而，据观察，它会引起一些应力，这些应力会显著影响制剂的稳定性。

晶体形成

冷冻过程中形成的冰和赋形剂有可能对药物制剂产生机械应力。例如，脂质体等囊泡系统具有液芯，其内部和外部核心中形成的冰晶会产生应力。此外，冰晶结构形成过程中的剪切应力会导致结构变形，进而导致药物泄漏。微小冰晶的形成和界面区域的大小与过冷程度的增加密切相关。冰-液相之间界面的存在有可能导致胶体结构的吸附和随后的破坏。

冷冻浓度的变化

快速冷冻可以显著提高残留液体部分中现有物质的浓度，可能对颗粒稳定性产生不利影响。颗粒距离的减小促进了颗粒间的相互作用，其中吸引力超过排斥力，形成颗粒聚集体。颗粒聚集可能由于静电排斥受阻和颗粒浓度增加而发生。冷冻浓缩可能会增加脂质双层颗粒（如脂质体和细胞外囊泡）的渗透压。渗透压差引起的水运动产生的机械应力可能会使膜破裂。脂质膜的选择性溶质渗透性影响冷冻渗透稳定性。这些变形过程可能导致包裹分子的泄漏并影响释放动力学。

缓冲液 pH 值变化

缓冲液在冷冻过程中会显著改变pH值，从而影响药物制剂的稳定性。由于溶解度有限，pH值的变化可能会上升，从而形成共晶（例如琥珀酸盐、酒石酸盐和磷酸钠）。此外，制剂温度的变化可能会影响缓冲液成分的pKa值，导致pH值波动（例如组氨酸、柠檬酸盐和苹果酸盐）。这种现象在磷酸钠缓冲液中表现得最为明显。具体而言，与单钠盐相比，磷酸二钠往往在更早的阶段结晶。该结晶过程可导致pH值显著下降。

相分离

冷冻过程可能会导致液相分离，称为液-液相分离。相分离系统表现出两个不同的玻璃化转变温度。某些聚合物和盐的组合已被证明会引起相分离。聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 和聚乙二醇 (PEG) 因其冷冻保护特性而备受关注。此外，葡聚糖和聚蔗糖等聚合物已知可作为塌陷温度调节剂。Heller 和团队的研究表明，即使加入 5% 的蔗糖或海藻糖，在冷冻干燥过程中，葡聚糖和 PEG 等聚合物的分离也会对血红蛋白的结构稳定性产生负面影响。

初级干燥

在极低压情况下，通常低至 0.01 hPa (mBar)，冰在此阶段升华（直接变成蒸汽）。产品和冷凝器冰表面之间的温差会产生推动升华的压力梯度。为了在此阶段获得合适的干燥产品外观，产品温度应始终比 Tc 低几度。温差越大，压力差越大，从而促进该过程更快进展。使用真空可有效去除空气分子，从而加快上述过程，使蒸汽分子更容易从样品穿过腔室进入冷凝器。在初级干燥过程中，通常在几小时到几天的时间内将搁板温度从 −40 逐渐升高到 +20 °C。来自上层搁板和小瓶侧壁的热传导和辐射热是搁板温度间接影响样品冰温的两种方式。

二级干燥

在此阶段，真空泵有助于建立脱溶剂所必需的低压环境，通常可使产品看起来干燥。产品中的结合水量（通常称为残留水）取决于产品在此阶段的暴露时间。通过将搁板温度升高到允许的最大值，可以有效控制和改善消除过程。然而，生物材料一般不会暴露在 40–45 °C 以上的温度下，因为在这种情况下它们会发生变性。对于储存在小瓶中的药物样品，标准做法是将水分含量保持在尽可能低的水平，理想情况下在 1–3% 的范围内，以最大程度地延长产品的使用寿命。

初级和二级干燥过程中的应力

在初级干燥阶段，冻结的水从固态直接转变为气态，而残留的吸附水在次级干燥阶段解吸。水替代理论和玻璃化概念有望应用于各种胶体系统。

水替代假说

该理论假设用糖分子取代胶体表面的水氢键，从而在干燥过程中维持分子结构。当糖分子强烈顺应胶体不平整的表面时，氢键的最大功效会发生，从而形成无定形状态而不是结晶状态。Crowe 等人是最初提出此概念用于脂质双层制剂（即脂质体）的研究人员（图 4）。在干燥条件下，磷脂头部基团内的间质水分子被添加的糖分子取代。因此，磷脂头部基团之间的距离可以得以维持，从而导致酰基链之间的范德华相互作用降低。该理论得到了分子模拟研究的支持，这些研究证明了磷脂和冷冻保护剂分子之间存在氢键连接。此外，添加冷冻保护剂可以改善冻干囊泡，为磷脂内层提供额外的稳定作用。

图4. 冻干和再水化过程中脂质双层的水替代机制。

玻璃化假说

玻璃化理论为胶体和化学物质在干燥状态下的稳定性提供了动力学解释。由于胶体被包裹在固体聚合物糖基质中，因此扩散、聚集、融合和其他形式降解的速率显著降低。在超过 Tg 的温度下，无定形基质转变为橡胶状态，其特征是失去动力学固定。在充分玻璃化的情况下，当 Tg 超过储存温度至少 10-20°C 时，主要的稳定性过程是水替换。在接近或超过 Tg 的温度下储存材料时，不发生玻璃化是保持稳定性的关键因素。然而，当进行冷冻干燥时，单独的玻璃化过程不能为制剂提供足够的保存，尤其是双层囊泡。在冻干工艺中，葡聚糖在稳定由鸡蛋磷脂酰胆碱组成的脂质体方面的效果不如海藻糖。这表明海藻糖与脂质双层的接触更充分，更有效地取代了水，这是由于其二糖结构较小所致。因此，玻璃化假说和水替代理论并不矛盾，而是互补的，因为两种机制都是冻干所必需的。

原文：S.Kumar, S.N.Sanap, M.Vasoya, et al., Application of lyophilization in pharmaceutical injectable formulations: An industry and regulatory perspective. Journal of Drug Delivery Science and Technology, 2024.