从FDA缺陷信看致突变杂质的鉴别与分类

2025-02-04

近日，收到某项目的FDA DMF文件缺陷信，要求补充研究的内容大部分都是涉及致突变杂质的鉴别、分类、定性和控制。

部分内容如下：

“We acknowledge that you discuss control strategy for the impurities which could be present in the drug substance in sections 3.2.S.2.3, 2.4, and 3.2. We also acknowledged that you have provided risk assessment of potential genotoxicity for the PMIs listed in the section 3.2.S.3.2 . However, we were unable to locate a hazard assessment for most of the actual as well as potential impurities in your submission. A complete hazard assessment for actual and potential impurities is recommended in Section 6 of the ICH M7 Guidance: Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk. Section 6 of the guidance describes the elements required for impurity hazard assessment and requires classification of each impurity according to Table 1. Classification of all impurities (Classes 1-5) should be justified by either predictive or empirical data and not by visual inspection or statements alone. In addition, please provide (Q)SAR data for the impurities such as Impurity SM2-1, Impurity SM2-2, Impurity SM2-5, ImpurityZJT1-1, Impurity ZJT1-3, Impurity ZJT1-5, Impurity ZJT2-B, and Impurity C to support your proposed classification/justification. Supporting data, as applicable, should accompany the control strategy based on the outcome of the (Q)SAR prediction”。因此，结合前期项目的致突变杂质的研究经验，结合现申报案例，和大家一起探讨致突变杂质的鉴别与分类。

前期，我们已经在文章《从ICHM7谈致癌物的分类》中简单介绍了致癌物的分类，其中就包括了致突变杂质的鉴别。ICH M7早期采用遗传毒性杂质（Genotoxic impurities）这个词语进行描述，后来修订为致突变杂质（mutagenic impurities），可见致突变物质、遗传毒性物质是有区别的，它们和致癌物的区别和联系可以用图1进行描述。致癌物是指导致细胞增殖失控，产生癌症的物质；遗传毒性是指通过直接或者间接的作用对细胞遗传物质产生损害的物质；而致突变物质是指在较低水平时也有可能直接引起DNA 损伤，导致DNA 突变，可能引发癌症的DNA 反应性物质，它可以通过标准的细菌回复突变试验（Ames试验）结果判定。所有的物质分为致癌物和非致癌物；致突变物质一定是遗传毒性物质，但是如果该致突变物质在“啮齿动物生物测定（2年）中显示为非致癌物”，那么该物质就不是致癌物，同样，某些遗传毒性物质在“啮齿动物生物测定（2年）中显示为非致癌物”，那么该物质也不是致癌物。

图1 致癌物、遗传毒性物质、致突变物质的关系

致突变物质在较低水平就会引起DNA反应性，理论上致突变物质是没有阈值机制的，也就是说只要是摄入0以上的该物质就会有患癌的风险。而其他无致突变性的遗传毒性或致癌物是有阈值机制的，基于Haber法则：浓度（C）×时长（T）=常数（k），只有摄入量达到常数（k）以上，才会有患癌的风险。下面我们通过一些物质案例来分析致癌物、遗传毒性物质、致突变物质与癌症之间的关系。

致突变致癌性物质：以甲醛（CAS：50-00-0）为例，甲醛存在于纺织品、化妆品、水发食品或豆制品、室内装饰的胶合板、细木工板、中密度纤维板和刨花板等人造板材中。甲醛的细菌回复突变（Ames）试验呈阳性，可引起骨髓细胞DNA断裂或交联，为致突变杂质^[2]。但是由于甲醛为内源性代谢物，并且广泛存在于自然环境中，其引入一个较高的可接受摄入量可能是合理的，其推荐的AI（可接受摄入量）为8000μg/天或215 ppb（取较低值）^[1]。

致突变非致癌性物质：以甲基溴（CAS：74-83-9）为例，甲基溴Ames试验呈阳性，为致突变物质^[3]，但是其仅被证明具有毒性，而无法判断其致癌性，因此世卫组织将其归为3类致癌物（不能确定能不能致癌，但是具有致癌的可能性），对于该化合物的控制，按照一般杂质控制即可。查询其毒理数据，大鼠口服LD50数据为104 mg/kg，狗口服12个月甲基溴的的NOEL(未观察到作用水平)为0.27 mg/kg bw，可根据上述数据计算其限度^[4]。

非致突变的遗传毒性致癌物：遗传毒性物质按机理可以分为致突变物质和染色体畸变物质，非致突变的遗传毒性致癌物也就是染色体畸变致癌物。以苯（CAS：71-43-2）为例，其以Ames试验呈阴性，为非致突变物质，但是其可引起染色体畸变或产生畸形胚胎，因此属于致染色体畸变物质^[5]。该物质不按照致突变杂质进行控制，但是需要按照致癌物研究，根据其毒理阈值进行控制，其限度不得过2ppm^[6]。

非致突变的遗传毒性非致癌物：也是致染色体畸变的非致癌物。以香芹酮（CAS：2244-16-8）为例，该物质含有警示结构，该种物质致突变性测试是阴性，致染色体畸变性测试是阳性，无致癌活性^[7]。按照ICH M7的分类应该属于Class 5分类，按照一般杂质进行控制^[1]。

非遗传毒性的致癌性杂质：以羟胺（CAS：7803-49-8）为例，其在细菌回复突变试验中呈阴性，不通过DNA反应性机制致癌，通过其他方式致癌^[8]。查询其毒理数据，女性24个月毒理试验，摄入量0.4 mg/kg bw/day，未发现与该物质相关的影响^[9]。

ICH M7关注的是致突变杂质，首先根据文献和数据库检索杂质的相关致癌性和Ames数据，然后根据结果分类为1,2,5类；如果无法找到相关数据，应进行SAR评估，根据评估结果分类为3类，4类和5类。但是，正如上述缺陷信中描述“Classification of all impurities (Classes 1-5) should be justified by either predictive or empirical data and not by visual inspection or statements alone”，1-5类杂质的分类应该通过预测或者经验数据来证明，而不是仅仅通过目视检查或陈述。在FDA2021年3月进行了DMF培训中，Drug Master File and Drug Substance Workshop – FDA CDER SBIA Events在day2: ICH M7(R1) – Chemistry and Manufacturing Control (CMC) Perspective on Hazard Assessment – Barbara O. Scott 中明确指出了相同的描述：“NOTE: Visual inspection of a compound for structural alerts for classification purposes is not M7 compliance”。

现在市面上的SAR评估软件较多，这些软件或方法都是基于专家规则或统计学规则。我最常用的软件是基于专家规则的Toxtree以及基于统计学规则的VEGA，如果这两个软件得出一致的结论，则一般不再继续讨论，如果得出的结果不相同或者出现如其中一个为阳性，则会对该杂质采用商业化评估软件如Derek/Sarah Nexus等软件进行评估，以商业化评估软件出具的结果为准。

我们以本次补充研究的杂质SM2-1为例介绍各软件的结果。首先对我们用Toxtree软件得出高风险结果，结果见图2。我们使用VEGA软件预测得出阴性数据，结果见图3。由于两个软件得出了相反结论，我们又使用商业化软件Derek/Sarah Nexus进行预测，结果为阴性，其结果见图4。综合上述预测结果，我们判定该杂质为致突变阴性，归为5类杂质，按照一般杂质进行控制。

图2 SM2-1致突变性预测结果（Toxtree软件）

图3 SM2-1致突变性预测结果（VEGA软件）

图4 SM2-1致突变性预测结果（Derek/Sarah Nexus软件）

致突变杂质的研究是药品CMC研究中的关键部分，现在不论是CDE，还是FDA、EDQM，都对致突变杂质的要求越来越严格，FDA甚至要求将所有的杂质都进行QSAR评估，以判断杂质的致突变性，因此论证杂质的致突变性、遗传毒性、致癌性越来越重要，并且需要在申报资料中详细阐述论证的过程和证据。因此我们首先需要明确各类杂质的定义和分类，然后提前评估警示结构、查询文献、进行QSAR评估，如有必要，进行Ames试验，防止因为补充研究影响审评进度，更防止因为将致突变杂质按一般杂质控制，导致产品不合格，影响项目审评。

参考文献

[1] Assessment and control of DNA reactive(mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk. ICH

[2] https://cebs.niehs.nih.gov/cebs/study/002-02185-0005-0000-3. NTP

[3] https://cebs.niehs.nih.gov/datasets/search/ames?casrn=74-83-9. NTP

[4] https://echa.europa.eu/registration-dossier/-/registered-dossier/5298/7/6/1. ECHA

[5] https://echa.europa.eu/registration-dossier/-/registered-dossier/16102/7/7/1. ECHA

[6] Q3C(R9)：Impurities: Guideline for Residual Solvents. ICH

[7] https://cebs.niehs.nih.gov/datasets/search/ames?casrn=2244- 16-8. NTP

[8] https://echa.europa.eu/registration-dossier/-/registered-dossier/17464/7/7/1.ECHA

[9] https://echa.europa.eu/registration-dossier/-/registered-dossier/16246/7/6/1.ECHA

内容来源：药事纵横

责任编辑：邵丽竹

审　　核：何发

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