引言

2012 年，《生物技术与生物工程》发表了一篇评论“疫苗工艺技术” ，重点介绍了用于预防人类各种传染病的疫苗生产的各种技术。在过去十年中，该领域取得了长足进步，部分原因是用于开发安全有效的 COVID-19 疫苗的资源大幅增加。这项艰苦工作的结果是，与使用蛋白质抗原作为疫苗等更传统的方法相比，引入并优先考虑了新的疫苗平台，特别是信使 RNA (mRNA) 和复制缺陷型腺病毒。

在过去 10 年中，含 DNA 和 RNA 的疫苗取得了巨大进步，这些疫苗本身并不含有目标抗原，而是携带指示接种者自身细胞产生抗原的指令。病毒载体和 mRNA 脂质纳米颗粒 (LNP) 疫苗属于这一类。自 2012 年以来，已有十种新的病毒载体疫苗和两种 mRNA-LNP 疫苗获得批准（表 1，译者注：原文数据如此）。自 2012 年的总结以来，许多其它重要疫苗也获得批准。Flucelvax® 是首个使用细胞培养技术生产的季节性流感疫苗，于 2012 年引入美国（诺华，现为 Seqiris）。Flucelvax 工艺使用悬浮 MDCK 细胞培养作为病毒繁殖的底物，而不是鸡蛋。该疫苗于 2007 年首次在欧洲获批，名称为 OptaFlu。一年后，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了 Flublok®，这是一种使用杆状病毒表达系统生产的昆虫培养重组流感疫苗（Protein Sciences Corporation，2017 年被赛诺菲收购）。该疫苗于 2016 年从三价改为四价，并于 2020 年获得欧洲药品管理局（EMA）批准。Flublok® 利用重组表达与所选毒株精确匹配的血凝素 (HA) 蛋白，避免了病毒适应鸡蛋或细胞培养而导致抗原漂移的潜在问题。

表 1. 病毒载体疫苗。

2017 年，FDA 批准葛兰素史克公司生产的带状疱疹 (HZ，shingles) 疫苗Shingrix，供 50 岁及以上的成年人使用。该疫苗是一种重组糖蛋白抗原，在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中生产并冻干，使用单独的 AS01B 佐剂悬液小瓶进行复溶。疫苗悬液含有 50 μg 重组水痘带状疱疹病毒 (VZV) 糖蛋白 E，其免疫原性增强，由两种佐剂组成：基于脂质体的 AS01B 佐剂系统，含有 50 μg 3-O-脱酰基-4′-单磷酰脂质 A (MPL) 和 50 μg Quillaja saponaria Molina，fraction 21。此外，2017 年，FDA批准了Dynavax 的Heplisav-B 乙肝疫苗，该疫苗含有新型胞嘧啶磷酸鸟苷 (CpG) 1018® 佐剂和重组蛋白亚单位抗原。该产品于 2019 年在欧洲获得批准。CpG 1018® 佐剂是一种修饰骨架寡核苷酸，可模仿细菌和病毒 DNA 来刺激先天免疫系统。2019 年，FDA 批准了 JYNNEOS® (Bavarian Nordic A/S)，一种天花和猴痘疫苗，适用于 18 岁及以上被确定为感染风险高的成年人。JYNNEOS® 是一种由 MVA-BN 毒株（一种减毒、非复制性正痘病毒）生产的活疫苗。 MVA-BN 在悬浮于不含任何直接动物来源物质的无血清培养基中的原代 CEF 细胞中生长，然后通过包括核酸酶消化在内的多个切向流过滤 (TFF) 步骤收获、纯化和浓缩。为了增加疫苗供应，FDA 于 2022 年 8 月批准了 JYNNEOS® 的紧急使用授权 (EUA)，用于向 18 岁以下的个人皮下 (sc) 给药(0.5 mL) 和向 18 岁及以上的个人皮内 (id) 给药 (0.1 mL)。

2020 年，世界卫生组织 (WHO) 批准了 nOPV2 的紧急使用清单 (EUL)，作为全球根除脊髓灰质炎的不断发展的战略的一部分。该疫苗使用在源自非洲绿猴肾脏的 Vero 细胞中制备的改良 Sabin 株 (nOPV2 株 S2/cre5/S15domV/rec1/hifi3) 的减毒活脊髓灰质炎病毒 2 型。为了降低疫苗源性脊髓灰质炎的发病率，该疫苗通过对亲本基因组进行5处修改，影响域 V、cre 元件和 RNA 依赖性 RNA 聚合酶，提高了遗传稳定性并降低了重组率。同样在 2020 年，WHO 对首个 Sabin 灭活脊髓灰质炎疫苗 (sIPV，注射剂，LG Chem) 进行了预审批。该疫苗采用基于微载体的 Vero 细胞生产，生产不使用野生型病毒，降低了逆转录突变的风险。此外，细胞生长培养基从含血清培养基改为无动物源性成分 (ACF) 培养基，在病毒灭活前增加了洗滤步骤，并使用重组胰蛋白酶。

2020 年初 COVID-19 疫情爆发后不久，全球 200 多种候选疫苗中的首批进入临床试验。到同年 12 月，监管机构授予了首批 EUA。到 2023 年 3 月，已接种超过 130 亿剂 COVID-19 疫苗。据估计，仅在 2021 年，新疫苗就挽救了 1400 多万人的生命。许多因素促成了疫苗研发的加速，包括对新模式（mRNA 和复制缺陷型腺病毒）的预先投资以及政府对临床研究的大量资助。约 40% 的剂量为之前确定的全病毒灭活类型，其余剂量则平均分为两种类型：mRNA-LNP 和腺病毒载体。从化学、生产和控制 (CMC) 的角度来看，为应对疫情，疫苗生产和分析也取得了重大进展，缩短了从证明有效性到广泛提供疫苗的时间线，支持将生产规模从每年数百万剂扩大到数十亿剂。生产规模和效率的变化需要复杂的分析表征能力。

表 2.十大 COVID-19 疫苗。

在本综述中，我们描述过去 10 年中取得的技术进步，这些进步使得开发和生产用于预防各种人类传染病的新型疫苗成为可能。其中一些进步，特别是在 mRNA 和病毒载体递送方面的进步，也适用于新兴的治疗性肿瘤疫苗领域。本综述的范围涵盖整个疫苗生产过程，从细胞培养和无细胞系统到制剂、纯化、稳定性、分析和监管环境的变化。

细胞培养

细胞培养越来越多地用于表达疫苗生产所需的抗原（图 1）。病毒表达可以在贴壁细胞系或悬浮驯化细胞系中实现。

图1. 基于细胞的病毒疫苗生产概要示意图。

贴壁细胞系

历史上，出于对安全问题的担忧，用于疫苗生产的细胞系的选择一直受到限制。随着时间的推移，出现了更多的选择，尤其是使用连续细胞系。基于贴壁细胞系的疫苗的一个例子是基于重组水泡性口炎病毒 (rVSV) 的埃博拉疫苗 rVSVΔG-ZEBOV-GP (V920，商品名 ERVEBO®)，其最初被构建并被描述为抗生物恐怖主义药物。rVSV Indiana 株包括了VSV 囊膜糖蛋白的缺失，被Zaire埃博拉病毒 (ZEBOV) Kikwit 1995 株表面糖蛋白取代，并且它在 Vero 细胞中生产。最近的创新还包括开发各种单位体积表面积非常大的一次性生物反应器 (SUB)；例如，Dohogne 及其同事描述的生物反应器。Drugmand 等人在2020 年描述的固定床反应器结合了强化连续和自动化一次性生物工艺方法。脊髓灰质炎疫苗的案例将上游工艺、下游工艺以及灭活联系在一起。

悬浮培养

多种疫苗细胞培养应用涉及悬浮培养。为了生产蛋白质，已成功使用杆状病毒表达的昆虫细胞培养 (Sf9)；例如，用于大规模生产 FDA 许可的流感疫苗的 HA 蛋白。或者，用于病毒生产的宿主细胞，例如 Vero 细胞或 PER.C6 细胞，可以驯化后悬浮培养。如果可以适应细胞培养，通常可以使用成熟的方法在经典的搅拌罐生物反应器中培养细胞。为生产抗体而开发的许多 CHO 细胞培养技术改进可以应用于疫苗生产。最近，行业已从 10,000–20,000 L 规模的不锈钢生物反应器过渡到约 3000 L 规模的SUB。Watterson 等人描述了一种使用 CHO 细胞表达的 SARS-CoV-2 Sclamp 候选疫苗，该疫苗适用于大规模商业生产，在2–8°C 下稳定。当与 MF59 佐剂配制时，它会引发中和抗体和 T 细胞反应，并在动物模型中提供保护。在 CHO 细胞中表达的 VZV 截短糖蛋白 E 是极为有效的Shingrix 疫苗的基础。用于疫苗的细胞培养技术与用于大规模生产抗体的技术非常相似。

在 COVID-19 大流行期间，牛津大学的研究人员领导了开发有效疫苗的工作，他们使用基于复制缺陷型腺病毒的平台来递送刺突蛋白。2022 年的 ECI 会议上介绍了该平台的规模放大。该平台涉及使用悬浮细胞培养表达复制缺陷型腺病毒以递送冠状病毒刺突蛋白，该平台可放大并由阿斯利康成功转移到多个生产基地，从而能够在约 18 个月内供应超过 10 亿剂COVID-19 疫苗。

微生物生产

传统上，微生物发酵平台被用于生产主要类别的疫苗，它们仍然至关重要。人乳头瘤病毒 (HPV) 的表面 L1 蛋白由酿酒酵母表达，并组装成病毒样颗粒 (VLP)，以产生Gardasil疫苗 。乙肝病毒 (HBV) 表面抗原由酿酒酵母或毕赤酵母表达。基于 DNA 质粒的候选疫苗通常由大肠杆菌细菌发酵制成。肺炎球菌结合疫苗由特定肺炎链球菌菌株表达的荚膜表面多糖 (CSP) 与白喉 CRM197 蛋白结合而成。一些重要的疫苗最初是减毒活病毒 (LAV) 疫苗，最终被带有佐剂系统的单一重组 VZV 糖蛋白所取代。过去十年，在开发能够实现高产量的替代培养物方面取得了进展，例如基于Thermothelomyces heterothallica真菌培养物(称为 C1) 的 Dyadic 平台。基于C1 的系统可以在数周内开发出表达免疫活性抗原的稳定菌株；总体而言，与其它成熟的系统相比，产量更高。基于 C1 的系统可以轻松扩展到工业规模，并且具有成本效益，其使用标准的微生物发酵罐和廉价的培养基。一种使用 C1 表达技术生产刺突蛋白关键受体结合域 (RBD) 成分的 COVID-19 候选疫苗目前正在临床中进行评估。麻省理工学院的研究人员开发了一个基于毕赤酵母的平台，该平台完全自动化，可用于生产包括疫苗抗原在内的多种蛋白质。之所以选择这种酵母，是因为它可以快速生长到高细胞密度，并具有可接受的蛋白质表达。目前正在使用具有端到端功能的高度自动化生物反应器系统，将类似技术应用于轮状病毒的三价候选疫苗的生产。

对于蛋白质抗原，技术挑战通常在于可重复地生产暴露关键表位的疫苗，以便它们被免疫系统识别。对于基于 VLP 的疫苗（例如 HPV 疫苗）尤其如此，复杂的分析能力对于成功至关重要。对于 mRNA 疫苗，大肠杆菌发酵仍然是生产体外转录 (IVT) 为 mRNA 所需质粒 DNA (pDNA) 模板的主要方法，例如辉瑞-BioNTech 的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗 Comirnaty® 和 Moderna 的 Spikevax®。pDNA 的无细胞合成正在取得长足进步，但由于酶和核苷酸/核苷成本高昂，其成本效益仍然不如微生物生产。 pDNA 是 IVT 反应的原材料，所需的总量明显少于 DNA 疫苗，因为可以从单个线性化的 pDNA 模板制作许多 mRNA 拷贝。用于 IVT 的 pDNA 序列通常需要大量重复元素（例如 poly(A) 尾），这可以为大肠杆菌细胞菌株的选择提供参考。许多业界主力菌株最初针对高 pDNA 产量而不是 pDNA 保真度进行了优化，但现在已有多种菌株能够正确复制具有重复元素的较大质粒。最近描述了一种在大肠杆菌中生产结合疫苗的新方法，即通过将关键酶插入细菌中。这种方法避免了分别生产蛋白质和多糖，然后进行纯化、化学结合和重复纯化的要求。

自从在不锈钢压力容器中实现500–5000 L 规模的发酵以来，发酵设备进行了多项创新，其自动化、清洁、验证和操作变得越来越复杂。由于建设成本高，在很多地区只有有限数量的大型生产基地。过去十年，微生物和细胞培养的一个重大进步是向一次性生物反应器（SUB）的过渡。人们对一次性生物反应器进行了大量投资，通过省去清洁和灭菌步骤并提高灵活性，可以生产小规模的微生物培养物。许多微生物培养中常见的工艺条件，例如压力、高空气流速、溶剂和严格的温度控制，将用于疫苗生产的 SUB 的上限规模限制在 3000 L 左右。

对于纯化，已经针对整个工作流程建立了一次性选项 - 从深层过滤、用于浓缩和洗滤的切向流，到用于层析的一次性层析柱。疫苗生产商正在努力建立一次性系统的第二来源供应商，以避免供应链问题。行业举措，正在建立灵活的一次性系统，该系统具有标准化、与独立于供应商的组件和连接。最终用户和技术提供商也在共同努力，为一次性组件提供可持续的回收和循环经济战略。

原文：B.Buckland, G.Sanyal, T.Ranheiim, et al., Vaccine process technology—A decade of progress. Biotechnology and Bioendineering, 2024.