优化过滤步骤、以提高产量和产品回收率，同时实现可接受的工艺经济性，这变得越来越具有挑战性。过滤技术供应商、生物制药制造商和监管机构之间的合作使得开发和采用新解决方案来应对这些挑战成为可能。

需要管理的几种过滤技术

Cytiva 过滤管理研发科学总监 Mike Collins 表示，过滤技术主要分为四类。它们包括预过滤器，例如用于初步澄清的深层过滤器；用于对最终产品进行灭菌的膜过滤器，也用于在二次澄清或病毒灭活 (VI) 后降低生物负荷；用于去除外来和内源性病毒的除病毒过滤器；以及用于浓缩工艺流体、用于洗滤以置换缓冲溶液和去除杂质的切向流过滤器。

SK pharmteco 病毒载体下游工艺开发总监 Chris Nieder 指出，深层过滤、切向流过滤 (TFF) 和除菌过滤通常用于各种模式的所有工艺，包括重组蛋白、基于抗体的疗法和病毒载体。“膜材料和截留分子量 (MWCO) 的选择因应用而异，供应商在提供多样化的解决方案组合方面发挥着至关重要的作用。近年来，供应商还专注于无菌 TFF 技术，以便在必要时实现封闭式工艺，”他说。

Nieder 观察到，虽然深层过滤器主要用于去除细胞和细胞碎片，并降低细胞收获时的浊度和可溶性杂质，但在单克隆抗体 (mAb) 的低 pH 病毒灭活之后也使用深层过滤器，以在精纯层析之前降低浊度和杂质。同时，TFF 用于许多应用，例如在捕获层析之前减少病毒载体的体积（从而减少上样时间）和 mAb 的缓冲液置换，用于捕获和精纯层析之间的缓冲液置换，以及用于最终制剂的浓缩和缓冲液置换。

MilliporeSigma 高级战略产品经理 Paul Beckett 表示，大多数深层过滤器都是无纺布介质层或用纤维加固并形成薄片的二氧化硅介质。他评论道：“深层过滤器的传统材料是纤维素和硅藻土 (DE，有机二氧化硅)，它们与带正电荷的树脂结合在一起，以结合核酸污染物。”正电荷有助于去除核酸污染物。二氧化硅（无论是 DE 还是合成的等效物）可吸附较大的分子和颗粒。Beckett 补充说，活性炭因其吸附较小分子的能力而越来越多地被使用。

Solventum 生物工艺过滤全球新产品营销部门的 Elliott Zell 表示，生物制造中的膜过滤用于清除较小的颗粒，通常尺寸小于 0.5 μm，可用于生物负荷控制、病毒截留、浓缩和缓冲液置换。他指出，平板或打褶膜用于除菌级（例如 0.2 μm）过滤器，用于许多单元操作中的生物负荷控制，并确保最终药品在灌装/完成过程中的无菌性。

Beckett 表示，用于除菌过滤的膜过滤器通常由表面改性聚醚砜 (PES) 制成，无论是载量还是通量，都具有高性能。它们还可以组合成多层设备，用于处理具有挑战性的进料；0.1 μm产品用于保护隔绝生物反应器周围的支原体；以及单层产品用于高速缓冲液过滤。

Beckett 观察到，TFF 过滤器通常由再生纤维素制成，用于高价值应用（mAb、病毒载体）和使用有机溶剂（PES 不兼容）时，而 PES 膜则用于血浆工艺等稳健、耐用的应用。平板膜包设备最为常见，因为它们易于放大并且可以重复使用，但他指出，在临床生产活动和密封性很重要的情况下，例如慢病毒 (LV) 载体和抗体偶联药物 (ADC) 生产，存在自持式囊式设计。

Beckett 还指出，TFF 在上游灌流式细胞培养中越来越多地用于去除废培养基和/或产品。不过，这些 TFF 过滤器的设计（中空纤维）与下游工艺中使用的过滤器有很大不同，通常由改性 PES 或聚偏二氟乙烯 (PVDF) 制成。

Beckett 表示，空气过滤器是一种不起眼且经常被忽视的过滤器类别。它们安装在储罐上以维持大气压力并实现排污和完整性测试操作。许多过滤器含有聚四氟乙烯 (PTFE) 膜，并使用蒸汽灭菌。当需要通过辐照灭菌时，PES 过滤器会用于特定应用。

据 Zell 介绍，中空纤维膜还可以用于纳滤装置，以清除内源性和外来病毒。“由于病毒体积小（通常小于 100 nm），膜过滤可以高效去除病毒，同时允许药物通过，”他说。

Lonza生物制药研发部副总监 Jean Aucamp 也认为纳滤过滤器在哺乳动物的生物工艺中无处不在，因为它们能够有效去除内源性和外来病毒。

不同的药物模式带来不同的过滤挑战

要成功实现过滤操作，必须克服许多挑战，这些挑战因方式、预期目标和具体的过滤操作而异。

单克隆抗体（mAb）

尽管单抗的生产平台已经很完善，但近年来，过滤方面的挑战在各个方面都显著增加。据 Collins 介绍，上游细胞培养的改进使生产滴度从十年前的 1-2 g/L 提高到 5-10 g/L 或更高。“滴度的提高通常伴随着更高的细胞密度（补料分批培养中高达 40 x 10^6 cells/mL）、更高的浊度以及必须去除的杂质 [宿主细胞蛋白 (HCP) 和宿主细胞 DNA] 的增加，”他解释说。

虽然 Beckett 认为，大规模澄清操作（包括连续离心和精细深层过滤）可以令人满意地处理这些问题，但两级深层过滤器可能难以获得足够高的载量，以实现设施适配且经济运行。因此，需要更高载量的澄清过滤器。Collins 指出，还需要功能化的深层过滤器来解决可溶性杂质水平增加的问题，如果不去除这些杂质，可能会影响后续的层析纯化步骤。

Beckett 表示，重组蛋白的上游滴度较高，这也给下游工艺早期使用中间膜过滤器进行的膜/除菌过滤带来了挑战。这里的问题还是载量不足。“具有极高颗粒负载容量的专用中间过滤器是可行的解决方案，”他指出。

Nieder 表示，由于用于皮下给药的产品浓度越来越高（200-300 g/L蛋白质），因此最终制剂也面临挑战。浓度越高，粘度越高，因此 TFF 压力也就越大。“在生产环境中管理这些高压可能是一个问题，”他说。除菌过滤也很困难，因为高粘度需要较低的流速，这会导致工艺时间延长。“过大的除菌过滤器可以弥补这一缺陷，但滞留体积会导致产品稀释，从而产生新的问题，”Nieder 评论道。

Collins指出，由于非特异性结合、高不可回收体积和高预冲洗要求而导致的产品损失高。

最后，Aucamp 观察到，纳滤去除病毒的挑战性主要在于其成本高，以及不同产品的过滤性能存在差异。此外，需要较低的产品浓度才能实现足够高的通量和较短的工艺时间，这与更高浓度的趋势背道而驰，并导致更大的工艺体积。后者可能在一定程度上抵消上游引入的工艺强化和体积降低措施。

积极的一面是，Beckett 指出，现有的标准 mAb 除病毒过滤技术非常有效。“我们预计去除的最小细小病毒的降低值将达到 >104 log10，这比 mAb 大不了多少，而且我们预计这一步的产品收率非常高，处理时间也很短，”他评论道。

双特异性抗体

除了传统单克隆抗体面临的挑战外，Beckett 表示，除病毒过滤也给双特异性抗体带来了困难。“这些分子类型有聚集的趋势，这大大降低了除病毒过滤器的处理量，而且它们比标准单克隆抗体更大。因此，获得经济的处理量成为这些具有挑战性的进料的一个问题，”他说。

抗体偶联药物

ADC 在生物药物领域独树一帜，因为它具有极强的药效，因此需要保护操作员和环境免受这些复杂分子的侵害。“与大多数生物工艺不同，这里的关键挑战是保护操作员免受有毒产品的侵害，而不是保护产品本身免受环境影响，”Beckett 说道。“这可能是一个问题，因为能够在生产过程中提供适当密封的高质量封闭设备有限，”他继续说道。

病毒载体

Nieder 表示，市场上大多数深层过滤器的设计都考虑到了带正电荷的 mAb 的澄清，这会极大地影响病毒载体的回收率。Beckett 表示，许多深层过滤器的二氧化硅成分和正电荷通常与 LV 载体结合得相当牢固，因为它们都很大并且带有净负电荷。

Collins 补充道，腺相关病毒 (AAV) 载体虽然比 LV 小，但也带负电荷，现有的深层过滤器由于对于两种载体都会导致吸附病毒，使得产品收率较低。一种替代方法是使用由纤维素或合成等效材料制成的低载量过滤器。

Nieder 表示，慢病毒除菌过滤通常会导致过滤载量低和回收率低。Beckett 解释说，这是因为慢病毒体积大且容易聚集，这使其无法轻易通过除菌级膜过滤器（0.22 µm 或更小）。

病毒载体（尤其是 LV）的另一个具有挑战性的过滤步骤是除病毒过滤，以去除不需要的病毒污染物。事实上，由于病毒载体的大小（AAV 约为 20 nm，LV 约为 120 nm），不可能使用 mAb 工艺中通常使用的除病毒过滤器，Collins 说。“因此，外来病毒进入产品流的风险更高，必须更加重视通过使用封闭式一次性技术等方法降低这种风险，并对进入工艺的任何工艺流体（如细胞培养液和缓冲液）应用除病毒过滤，”他说。

然而，使用完全封闭的无菌工艺可以避免除菌过滤，这本身也带来了一系列挑战。Beckett强调，需要有合适孔径的封闭式无菌设备来进行 TFF，但这些设备可能并不容易获得。调整配方、以减少聚集可能对某些病毒载体有帮助。他还指出，其它大型且脆弱的产品（如外泌体和脂质纳米颗粒）也面临着类似的挑战。

质粒DNA

由于核酸带有很强的负电荷，质粒 DNA (pDNA) 产品在澄清深层过滤方面与病毒载体存在类似的问题。Beckett说，pDNA 的收率可能相当低，而且通常需要改变配方和/或使用不带电的介质。

当前的一些进步

Beckett 指出，尽管膜介质所用的化学技术正在取得进展，但许多技术发展都与现有化学技术的应用和新设备设计的新方法有关。“因此，必须在整个生物工艺行业的更广泛背景下看待这些进步，而生物工艺行业本身也在不断发展。制造商面临着降低产品成本和加快上市速度的巨大压力，这影响着生物工艺的各个方面。因此，尽管已经引入了新的解决方案，但过滤技术的许多最新进展都是渐进式的，而不是革命性的，一些新方法，如收获预处理的絮凝，都是从邻近行业借鉴而来，”他总结道。

单程 TFF (SPTFF) 是现有技术的新应用示例。Nieder 表示：“这种新的操作模式（而不是新的过滤器类型）正越来越广泛地用于高浓度 mAb 的最终制剂。它在学术界很常见，现在终于被工业界采用，因为如果开发得当，SPTFF 可实现稳态工艺，与传统 TFF 相比，能够实现高浓度（200-300 g/L）和更低的系统压力。”

可持续性是一个考虑因素

在考虑潜在的新型过滤技术时，与生物工艺开发和制造的所有方面一样，评估其对生物制药生产运营可持续性的潜在影响至关重要。“任何新产品/设备/技术的设计都必须考虑到可持续性，”Beckett 表示。这种设计可以减少冲洗用水量、减少包装材料、减少占地面积，或者消除使用氢氟碳化合物进行高性能完整性测试。“在解决重要过滤挑战的同时提供更可持续替代方案的新解决方案更有可能得到广泛采用，”他总结道。

值得注意的进步

尽管过滤技术的大多数进步都是渐进性的，但一些值得注意的发展已导致各种模式的改进。

深层过滤已引起广泛关注。Beckett 指出，一项基本改进是转向合成介质，这种介质不仅性能相当，而且效率更高，尤其是冲洗体积和验证要求，这反过来又带来了更具吸引力的工艺经济性。

Solventum 公司生物工艺科学全球负责人 Alexei Voloshin 表示，为了应对 mAb 更高的细胞密度、滴度和杂质水平带来的挑战，所采用的方法包括澄清前絮凝、声波分离和切向流深层过滤 (TFDF)。不过，他补充说，这些解决方案在放大到大处理体积时仍然很复杂。

阴离子交换 (AEX) 纤维层析法是另一种解决方案，据 Voloshin 称，该解决方案已被证明可放大至大规模商业化生产。“这种方法利用一次性囊式滤器中的 Q 化学功能化纤维床来澄清收获的细胞培养液，并将过滤器式流穿操作的简易性和可放大性与层析法的分离精度相结合，”他解释说。

事实上，Voloshin 认为，功能化纤维技术可以对整个工艺杂质范围（从整个细胞到细胞培养基成分）进行层析分离。他补充说，商业解决方案可以逐步改变工艺设计速度、规模放大以及提高工艺经济性。“例如，Solventum（前身为 3M Health Care）提供了一个功能化纤维澄清平台，旨在加速在现代强化中国仓鼠卵巢细胞培养中表达的 mAb 候选物的开发，从发现到商业化生产，”他说。

Nieder 指出，TFDF 也越来越广泛地用于 LV 载体的澄清。他观察到：“通过将 TFF 与具有深层的膜（如深层过滤器）相结合，TFDF 比传统的深层过滤器具有更高的回收率和载量。”

Voloshin 表示，对于细胞和基因治疗领域中较大的部分，基于新想法的新型分离技术也正在探索中。他强调，功能化纤维床和聚合物涂层微球可提供类似过滤器的流穿功能，同时通过尺寸、电荷或其它特性捕获与工艺相关的污染物。“在这些情况下，传统的过滤和层析法之间的界限变得模糊，以充分利用药物物质的尺寸和生物化学，”他指出。“随着该领域的发展，我们很可能会看到更先进的类似过滤器的工艺技术，这些技术采用先进的物理和化学作为分离机制的核心，”Voloshin 相信。

据 Beckett 介绍，在除菌过滤领域，设备设计的基本改进包括能够在灌装/完成隔离器内进行现场完整性测试。更先进的发展包括改进膜，使其具有更高的载量、更低的蛋白质结合率，并能够减少占地面积。

后者的一个例子是 Cytiva 的新型除菌过滤技术，该技术解决了高颗粒负载导致过滤器过早堵塞的问题，从而解决了与高浓度生物进样料液相关的挑战。“这种新型除菌过滤器可以提供高吞吐量，而无需加大尺寸，从而避免了滞留体积增加以及与昂贵的产品损失相关的问题，”Collins 说。

该领域正在考虑的另一个问题是，是否需要经过验证的除菌级过滤器来进行中间过滤，以控制单元操作之间的生物负荷/颗粒，并且通常用于保护层析柱免受污染和早期下游操作中非关键缓冲液的过滤。“鉴于过滤器成本的很大一部分是测试、验证和记录以证明除菌级，更开放的膜或记录较少的膜可能更便宜，并且对于生物纯化过程早期出现的具有挑战性的进料具有更高的容量，”Beckett 表示。

最后，Beckett指出，最近发布的备受期待的 EudraLex 第 4 卷附件 I 更新版关于无菌产品的生产，非常明确地列出了对膜过滤的监管要求。“某些要求，尤其是关于使用前灭菌后完整性测试 (PUPSIT) 的要求，推动了膜过滤的创新和技术进步，以确保现在和将来的监管合规性，”他说。

据 Beckett 介绍，TFF 技术的进步包括开放式超滤膜系列（标称截留分子量为 300-1000 kDa），该系列膜在膜制造过程中的孔径控制问题已经得到克服，从而提供了更为强大的分离解决方案；通道筛分技术的创新允许处理高浓度产品；封闭式灭菌设备可减少临时临床活动的验证开销，并允许封闭工艺，以确保产品和/或操作员的安全。

Beckett 表示，对于除病毒过滤，进展主要集中在进一步提高现有膜的高载量和稳健性，以支持更脏的进料和更具挑战性的产品，例如双特异性抗体。他补充说，至于其它过滤应用，随着强化、集成和封闭工艺的需求越来越大，可辐照的封闭设计也正在整个行业中开发中。

合作对发展至关重要

Voloshin 指出，由于过滤在生物工艺设计中发挥着核心作用，并且涉及到工艺的许多部分，因此下一代过滤和类似过滤器的解决方案无疑将由技术提供商、生物制药制造商和监管机构共同设计。事实上，生物工艺过滤技术的进步并非凭空而来。药品制造商和监管机构为新技术提出了要求。制造商在开发利用现有技术的新方法方面也发挥着重要作用。

技术供应商（有时是学术实验室）主要负责开发新解决方案。Collins表示：“所有团队必须通力合作，才能有效推进新技术的发展。”

Beckett补充说，制造商发挥着至关重要的作用，他们要告知供应商他们最大的痛点、工艺过程中存在的瓶颈，以及产品需要如何表现才能克服与受监管流程中的变更控制相关的进入壁垒。

“与供应商合作是帮助新产品进入市场的绝佳方式，”Nieder 表示同意。他观察到，与供应商合作还可以提供机会评估早期开发的产品并提供反馈意见以改进设计和性能。

改变预期

随着生物技术产业的发展，过滤的基本理念已经取得了长足进步。随着生物工艺设计的发展，Zell 预计会看到更多具有创造性和令人兴奋的类似过滤器的分离技术。

“完全流穿式生物制药工艺的基本前提即将出现，未来先进的过滤解决方案将使世界各地的生物制药产品更加安全、更加有效、更加容易获得，”Zell 断言。

Beckett 补充说，生物制药的生产模式正在发生转变。变化包括商品成本的新压力、需要 60,000 升生物反应器容量的重磅药物的减少，以及 ADC 和病毒基因疗法等新型生物制药，这些药物比现有类别的药物功效更强，因此所需的产量更少。

“过滤技术必须适应 2040 年的生物工艺设施，而不是现在。这种设施可能要小得多，完全一次性使用，多产品生产，设计用于在一条生产线上灵活生产多种产品类型。为了支持这样的设施，过滤技术必须更小、更便宜和/或更快，这是生物工艺强化的三个基本要素，”Beckett总结道。