狂犬病作为迄今为止人类病死率最高的急性传染病之一，一旦发病，死亡率接近 100%[1]。其是一种由狂犬病毒引起的人兽共患传染病，有着对所有温血动物都易感的特性，犬类是主要宿主。当人类被患有狂犬病的宠物咬伤后，宠物唾液中的狂犬病毒经破损皮肤侵入人体，引发感染。经过多年发展，神经组织疫苗、禽胚疫苗、细胞培养疫苗等狂犬疫苗相继问世，使狂犬病得到了有效的控制。
本文以国内较为成熟的 Vero 细胞狂犬疫苗为例，对疫苗生产工艺流程进行介绍[2]：
细胞从细胞库中取出后复苏，将复苏后的单层细胞消化，分散成均匀的细胞，加入培养液置于适宜温度下培养成均匀单层细胞。
将人用狂犬疫苗减毒株稀释到适宜浓度后，接种于工作代 Vero 细胞上。
接种后的 Vero 细胞经培养，更换维持液后，进行多次病毒液收获。
检定合格的同一细胞批生产的病毒收获液进行合并后，经超滤或其他适宜方法浓缩至规定的蛋白质含量范围。
向浓缩后的病毒收获液中加入 β-丙内酯进行灭活，然后置于独立设置的待验区，待灭活结果验证通过后进入下一工序。
完全灭活后的病毒液经柱色谱法等方法进行纯化，纯化后取样、调节 pH 值并加入人血白蛋白等稳定剂制备为原液。
已制备完成的原液按要求的同一蛋白质含量或抗原含量进行配制，且总蛋白质含量应不高于80 μg/剂，加入适宜的稳定剂即为半成品。
配制完成的半成品在分装车间完成灌装，之后在包装车间装盒装箱后入库。
图1 狂犬疫苗生产流程
欧盟在其灭菌决策指南中，将终端湿热灭菌作为最优选择，当产品由于热稳定性等原因无法接受最终灭菌时，考虑除菌过滤工艺和无菌操作相结合的方式，如果产品不耐受除菌过滤，或者不能进行除菌过滤，则通过无菌操作来确保产品达到一定的无菌水平。
狂犬疫苗不能最终灭菌且无法实现终端除菌过滤，在疫苗原液生产过程中，最后一步可除菌或灭菌工艺之后，所有操作均应为无菌操作[3]。这在欧盟的决策树中，被认为是一种风险较高的工艺。同时，大量的高级别洁净区也导致后期车间运行维护成本高昂。如何在保证产品质量的情况下降低运行维护成本成了狂犬疫苗车间设计的一大难点。
为解决狂犬疫苗车间设计时所遇到的问题，本文提出以下几点设计原则：
（2）以工艺流程为顺序安排各个功能区位置，提高面积利用率。
（4）核心生产区尽量减少开口操作，降低背景环境级别，节约能耗。
本文结合相关法律法规要求及提出的设计原则，对某狂犬疫苗车间设计方案进行分析讨论。该方案外轮廓为矩形，北侧为公用工程区，南侧为生产区，根据工艺流程及 2010 版 GMP 对无菌药品和生物制品的要求，将整个生产区分为细胞区、病毒区、培养收获区、灭活区、待验区、纯化区、半成品制备区、清洗区、配液区、分装区、包装区等，各区域按照工艺流程排布，减少人员和物料传递过程中不必要的反复（图2）。同时，将主要操作间布置在靠近外围环形走廊的位置，保证了车间的参观效果。参观人员进入车间后，沿外围环形走廊即可对核心操作间进行参观，过程一气呵成，不走回头路。
图2 狂犬疫苗厂房工艺布局
细胞区的主要功能是为毒种制备和病毒液培养收获提供细胞，应靠近病毒区和培养收获区布置，方便细胞转运。此区域培养规模相对较小，可采用转瓶培养工艺。为保证产品质量，该区域背景环境应设置为 B 级，其中装瓶等开口操作须在 B 级背景的局部 A 级层流下进行。
细胞培养时可使用恒温室或培养箱（图3）。若采用恒温室方案，由于此区域背景环境为 B 级，在设计中，需根据业主的生产排班，计算出合理的恒温室面积，保证满足生产需要的同时将后期运行维护成本降到最低。恒温室长宽比例要适中，方便设置回风道，保证恒温室内温度的均一性。若采用培养箱方案，可将装瓶等操作区域以及培养箱开口区域设置为 B级，实现无菌操作，而培养箱主体则放置在低级别区，这样既减少了 B 级区面积，也降低了设备运行及维修时对 B 级区环境的影响。
图3 某狂犬疫苗生产厂房细胞区设计方案
毒种制备区存在生物活性风险，为减少污染和交叉污染的风险，采用单向流模式布局，设置进入走廊和退出走廊。生产开始时工作人员经换鞋、更衣、洗手等操作进入有毒生产区；生产结束后，将衣物脱至退更间并退回到换鞋间进行洗手消毒，退出生产区。退更间的设置应靠近灭活间，二者通过传递窗相连，脱下的衣物可通过传递窗传入灭活间进行灭活。生产所使用的物料也经进入走廊进入生产区，生产结束后，产生的废弃物由专人收集，经退出走廊运送至灭活间，灭活后离开生产区。该区域背景环境可设置为 B 级。
培养收获区是重点参观区域，应靠近参观走廊布置。该区培养规模较大，目前国内企业已逐步使用反应器载体培养工艺替代传统的转瓶工艺，有学者曾对使用不同培养方式生产 Vero 细胞狂犬疫苗进行研究，发现使用反应器微载体培养工艺后，产量达到了转瓶工艺的 19 倍[4]。同时，反应器微载体培养具有全密闭，可在线清洗、灭菌的优点，减少了细胞被污染的可能性。该区域背景环境可设置为 D 级，大大降低了车间能耗。
灭活区应靠近培养收获区布置，减少管道长度，降低病毒收获液损耗。
由于灭活后需要等待验证结果，因此设立独立的待验区，该区域设置单独人物流。如果验证结果显示灭活不彻底，可对该区域进行全面消杀，以消除可能存在的安全隐患。
纯化区无生物活性，主要采用层析设备，无开口操作，背景环境可设置为 C 级。
清洗区为各个区域提供生产所需的物料，器皿等物品，平面布局时可考虑将清洗区放置于与各生产区相邻的位置并预留物品传输走廊，确保清洗灭菌后的物品能输送到各个使用区域。该区域内部配置全自动清洗机，脉动真空灭菌柜等设备，保证清洗灭菌流程满足生产需要。该区域背景环境可设置为 D 级。
配液区为细胞培养，纯化等工序提供培养基和缓冲液，应紧邻用液量大的区域布置。由于车间使用的液体种类多，用量大，需结合实际生产排班计算罐体数量与体积，降低设备投资。设备布局时，可将罐体集中设置，方便管理和清洗灭菌，配制好的液体可直接通过管路穿墙输送到使用点。配液罐及储液罐清洗使用的 CIP 可就近布置。本区域背景环境可设置为 C 级。
公用工程区域也是车间不可或缺的一部分，目前国际流行的黑白分区理念，即把生产区定义为白区，把公用工程站房定义为黑区，黑区白区严格分开，检修人员不进入白区，避免对生产造成干扰。
作为厂房的一部分，合理的公用工程设计方案也是至关重要的。
温度、湿度的控制要求或精度要求差别较大的系统宜分开设置；单向流系统与非单向流系统要分开设置；有毒区域与无毒区域系统应分开设置[5]。
排水按照高活和非高活、带压和非带压、高浓度废水和低浓度废水、生产废水、生活废水、高温水分别排放的原则设置排水管道系统。
普通生产废水排至污水管道，高温排水经降温池降温后排至污水管道，高活废水排至废液灭活系统经高温灭活后排至污水管道。工艺设备排水管道采取防污染倒灌措施，设置空气隔断装置。
对于重要负荷，采用放射式供电的配电方式；对于一般负荷及正常照明负荷，采用树干式与放射式相结合的配电方式。工艺区设置专用配电箱为设备配电，重要工艺设备采用 UPS 电源供电。
狂犬疫苗作为一种不能最终灭菌且无法实现终端除菌过滤的产品，对车间的设计提出了较高的要求。本文基于对狂犬疫苗生产工艺的研究，综合考虑生物安全、经济效益等因素，提出了狂犬疫苗生产车间在设计时，应遵守分区明确、布局紧凑、防止污染、节约能源的原则。采用这些原则进行设计，能够更好地满足 GMP 的要求，降低生产风险。同时，也希望这些原则可以带给使用者与设计者一些新的思路。
[1] 杨妍梅，冯若飞，马忠仁 . 狂犬病病毒实验室检测方法研究进展 [J]. 动物医学进展，2013，34（8）：102-106.
[2] 国家药典委员会 . 中华人民共和国药典（2020 年版三部）[M].北京 ：中国医药出版社，2020.
[3] 徐哲 . 病毒类疫苗的无菌生产工艺布局 [J]. 工程与装备，2018（20）：33-37.
[4] 李平忠，沈伟，余芬 . 用微载体培养 Vero 细胞制备狂犬疫苗[2]. 第三军医大学学报 2006，28（23）：2374-2376
[5] 尹维友 . 生物制剂厂房设计关键技术探讨 [J]. 洁净与空调技术，2018，25（2）：89-92.
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