1.引言

疫苗在预防传染病传播方面显示出了卓越的效果，每年挽救了无数生命。近几十年来疫苗的广泛实施导致了天花的根除以及脊髓灰质炎、麻疹等传染病的极低发病率。世界卫生组织报告称，疫苗每年可预防约200万例麻疹、流感、百日咳和破伤风死亡病例。此外，疫苗在癌症管理中的使用在临床前试验中显示出强大的效果，成为免疫肿瘤学领域最有前途的治疗方法之一，并且受到了前所未有的关注。传统疫苗有几个缺点，可能限制了它们在疾病预防和治疗中的应用。例如，树突状细胞（DC）疫苗的开发过程涉及劳动密集和耗时的过程，需要准备患者自体细胞。基于微生物的疫苗的工程和制造过程复杂繁琐。肽疫苗表现出MHC限制，选择性激活单克隆T细胞，因此存在免疫逃逸的高风险。DNA疫苗存在基因组改变、长期表达和产生抗DNA自身抗体的风险，这可能阻碍了它们在人类中的使用。因此，选择一种具有前景价值的疫苗格式对于疾病预防和治疗至关重要。使用信使RNA（mRNA）的疫苗，一种作为蛋白质翻译模板的单核苷酸序列，比传统疫苗具有多个有益特点。的确，mRNA疫苗使用体内细胞作为自然诱导先天和适应性免疫的核心设施（图1），使蛋白质产品能够进行翻译后修饰并完全发挥作用，允许在宿主细胞中正确翻译折叠和组装多聚体和多功能蛋白质，这些蛋白质无法在生物反应器中产生，允许将产生的细胞内和跨膜蛋白质转移到其适当的细胞位置。mRNA疫苗可以设计为编码任何基于疾病独特属性的抗原。此外，与DNA疫苗相比，mRNA疫苗避免了宿主基因组中插入性突变的潜在风险，并引起可调节的表达所选抗原。从商业角度来看，mRNA疫苗允许通过体外高效转录反应的无细胞过程快速开发和大规模生产，这也极具成本效益。值得注意的是，尽管与其他疫苗形式（例如，稳定性差和强大的免疫原性限制了mRNA疫苗在体内的使用）相比，mRNA本身也有几种缺点，但通过改进修饰和传递在很大程度上解决了这些障碍，确保了体内稳定性的维持以及在引发强大免疫反应和由持久功能引起的不可逆不良反应之间的平衡。出于所有这些原因，mRNA疫苗已成为预防和治疗多种疾病的有前途的模式。

图1 mRNA疫苗对免疫激活的双重效应。mRNA疫苗诱导先天和适应性免疫。外源性mRNA通过内吞作用被抗原呈递细胞摄取，在内体中的TLR3和TLR7/8以及细胞质中的RIG-1、NOD2、LGP2和MDA-5感知，引发强烈的IFN-I反应，随后触发促炎细胞因子的产生，从而激活先天免疫（左侧）。mRNA编码的蛋白质释放出细胞外激活B细胞，而mRNA编码的或重新内吞的蛋白质在蛋白酶体中被降解为肽段，呈现在MHC-I或MHC-II分子上，共同激活适应性免疫（右侧）。本图使用Adobe Illustrator创建，并受到这两篇论文的启发。

这篇综述深入探讨了mRNA疫苗的技术基础，涵盖了mRNA设计、合成、传递和佐剂技术等关键方面。这篇综述系统地分析了用于多种医疗状况的代表性mRNA疫苗，包括传染病、癌症、免疫性疾病、组织损伤和罕见疾病。此外，本综述还包含了对mRNA疫苗开发和实施中当前障碍和潜在可能性的前瞻性讨论。

2.mRNA疫苗开发

mRNA疫苗的开发是数十年广泛研究的成果。mRNA的发现可以追溯到1961年，1969年首次实现了体外转录mRNA用于体外蛋白质表达。1990年，体外转录的mRNA成功地作为体内小鼠骨骼肌细胞合成蛋白质的模板，标志着体内mRNA表达的突破，并为mRNA疫苗的开发奠定了基础。1992年，将抗利尿激素mRNA注入下丘脑，成功表达并产生了生理反应。随后，在1993年和1995年，发现mRNA能够引发先天和适应性免疫。尽管这些发现前景光明，但由于对mRNA的不稳定性、体内运输效率低下以及可能的先天免疫原性的担忧，mRNA疫苗的最初开发面临有限的投资。然而，由于其安全性、设计简单和制造简便，mRNA的研究一直在持续。最终，这种坚持不懈得到了回报，这一点从针对COVID-19的高度有效的mRNA疫苗的开发中可以看出，这些疫苗在控制大流行的持续努力中发挥了关键作用。迄今为止，已经建立了包括设计、合成和传递技术在内的mRNA疫苗开发的全面框架（图2）。

图2 mRNA疫苗开发流程。mRNA疫苗的开发包括一系列步骤，包括序列设计、体外转录、纯化、纳米沉淀和过滤。本图使用Adobe Illustrator创建，并参考了这篇论文。

2.1.mRNA设计

mRNA疫苗的进步由于mRNA的不稳定性以及翻译效率低下而面临重大障碍。体外转录的mRNA由五个主要元素组成，即5'帽、5'非翻译区（UTR）、开放阅读框（ORF）、3'非翻译区和聚（A）尾，所有这些都模拟了内源性mRNA的结构。为了提高mRNA的翻译效率，科学家们设计了各种技术来修改这些组成部分并优化mRNA设计。

5'帽是一种位于成熟mRNA分子5'端的修饰过的核苷酸结构，由一个通过三磷酸盐键与mRNA连接的鸟嘌呤核苷酸组成，鸟嘌呤的第7位和/或第一个转录核苷酸的2'位上还有额外的甲基化。它在mRNA稳定性和功能的多个方面发挥着至关重要的作用，包括防止外切酶的降解，提高mRNA翻译效率，并促进从核到细胞质的运输。在mRNA疫苗中，5'帽结构的包含对mRNA分子的稳定化和编码蛋白的有效翻译至关重要。值得注意的是，5'帽修饰，特别是m7G帽，通过促进其被翻译启动复合物识别，提高了mRNA的翻译效率。此外，先前的研究强调了m7G帽保护mRNA免受核酸酶降解的能力，从而提高了其稳定性和免疫原性。

聚(A)尾是mRNA的一个关键的转录后修饰，显著地促进了其稳定性、输出和翻译。在真核细胞中，mRNA成熟的过程包括在mRNA分子的3'端添加一长串腺苷酸，其典型长度范围为50-250个核苷酸。聚(A)尾的一个关键功能是保护mRNA免受外切酶的降解，这些酶可以从其末端降解RNA。此外，聚(A)尾促进了mRNA从核到细胞质的输出，在那里它可以被翻译成蛋白质。此外，聚(A)尾参与了蛋白质合成的启动。它与聚(A)结合蛋白相互作用，后者招募了核糖体到mRNA上，从而促进了有效的翻译。在mRNA疫苗中引入聚(A)尾有两个关键目的。首先，它稳定了mRNA分子，并保护它免受细胞酶的降解。其次，它提高了mRNA的翻译效率，导致抗原表达增加和更强的免疫反应。

mRNA的非翻译区(UTR)在基因表达调控中发挥着至关重要的作用。位于5'和3'端的这些区域参与控制mRNA的稳定性、翻译效率和亚细胞定位，从而调节相应蛋白质的产生和功能。mRNA的编码序列决定了蛋白质序列，而UTRs调节其表达。具体来说，5'UTR在调节mRNA稳定性和翻译效率方面发挥着关键作用，对5'帽结构和5'UTR长度的修改增强了这两者。5'UTR的选择性剪接可以改变mRNA的翻译效率。同样，3'UTR通过结合调节蛋白和微小RNA来调节mRNA稳定性，这些微小RNA可以使mRNA不稳定或稳定。修改3'UTR，例如，通过添加聚(A)尾，可以增强mRNA稳定性和蛋白质表达。在mRNA疫苗设计中，UTRs被精心设计以优化蛋白质表达和免疫反应。5'UTR可以被修改以提高翻译效率，而3'UTR可以被修改以稳定mRNA并延长蛋白质表达，从而提高mRNA疫苗的免疫原性和有效性。

开放阅读框(ORF)，从起始密码子开始，以终止密码子结束，是mRNA被核糖体翻译成蛋白质的关键部分。ORF的长度可以从几百到几千个核苷酸不等。ORF序列负责确定合成蛋白质的身份和结构，因此在mRNA的有效性中发挥着关键作用。在mRNA疫苗的背景下，ORF设计的重要性至关重要，因为它直接影响目标抗原的产生。mRNA疫苗技术的进步促进了它们针对新出现的传染病的快速设计和生产。ORF序列已经过优化，以增强mRNA稳定性和翻译效率。一种方法是优化ORF的密码子使用，从而提高翻译效率并减少过早终止。另一种策略是整合特定的RNA修饰，包括伪尿苷，以提高mRNA翻译的稳定性和准确性。此外，在ORF中使用非天然氨基酸可以扩大抗原呈现的表位库，从而可能诱导更广泛的免疫反应。高效有效的ORF设计策略的开发对mRNA疫苗的成功至关重要。这些努力预计将导致开发出更强大、更多功能的mRNA疫苗，为疾病预防和治疗提供广泛的应用前景。

值得注意的是，修饰过的核苷酸由于其增强mRNA分子稳定性、翻译效率和免疫原性的能力，在mRNA技术中获得了广泛流行。这些核苷酸类似物可以整合到体外转录的mRNA序列中，从而形成具有比未修饰的对应物更优越属性的修饰过的mRNA分子。在mRNA中最常用的修饰过的核苷酸包括伪尿苷、5-甲基胞嘧啶和2-硫尿苷。伪尿苷提高mRNA稳定性和翻译效率，同时减少先天免疫反应的激活。5-甲基胞嘧啶提高蛋白质表达水平，而2-硫尿苷通过增加mRNA和核糖体之间的结合亲和力来提高翻译精度。其他修饰，包括N1-甲基伪尿苷和5-甲氧基尿苷，也已被用来提高mRNA稳定性和翻译效率。在mRNA技术中整合修饰过的核苷酸对于开发更有效、更安全基于mRNA的治疗，包括疫苗和针对人类各种疾病的基因疗法，具有相当的前景。

2.2.mRNA疫苗合成

体外转录生产mRNA涉及使用RNA聚合酶酶从DNA模板在活细胞外合成mRNA。上游过程包括使用质粒作为模板，并使用T7、SP6或T3 RNA聚合酶转录成初级mRNA。这个反应只需要几个小时，并且每毫升反应可以得到几毫克的初级mRNA。随后，在转录过程中使用帽子类似物代替天然底物或通过使用RNA 2'-O-核糖转移酶、RNA甲基转移酶和甲基供体底物的两步酶反应来对初级mRNA进行加帽。尽管使用帽子类似物是一种快速且实用的方法来加帽mRNA，但其使用受到相对较高的成本和与m7GpppN帽子结构相关的不稳定性的限制。相反，两步酶反应产生了一个更真实和稳定的m7GpppN帽子结构，尽管需要额外的步骤和酶反应，以及精心选择合适的酶和甲基供体底物。为了满足临床质量标准，上游产生的mRNA需要经过多个纯化步骤，以从反应混合物中分离和纯化它。排阻色谱法是一种常用的基于大小和形状分离mRNA分子的方法。这种方法既简单又温和，因此有效去除包括残留DNA、RNA和蛋白质在内的杂质。反相高效液相色谱法根据mRNA分子的疏水性进行分离，从而提供高分辨率和纯度，但可能耗时并需要昂贵的设备。亲和色谱法是另一种纯化mRNA疫苗的策略，其中使用特定的配体来捕获和纯化mRNA分子。这种方法可以提供高特异性和产量，但可能需要额外的配体固定步骤，并且可能成本较高。离子交换色谱法是另一种常用的mRNA纯化方法，它根据分子的电荷进行分离。尽管这种方法具有高产量和纯度，但可能需要多个步骤和仔细的优化以获得最佳结果。除了基于色谱的方法外，沉淀法方法，包括异丙醇或乙醇沉淀，也可以用来纯化mRNA疫苗。这些方法简单且成本效益高，但在去除杂质方面效果较差，可能需要额外的重悬和质量控制步骤。最终，为mRNA疫苗选择的纯化方法取决于各种因素，包括所需的纯度水平、可扩展性、成本和下游应用。

2.3.mRNA疫苗传递

mRNA疫苗进入细胞的传递由于RNA的固有不稳定性以及需要在细胞外环境中保护其免受降解而面临重大挑战。在过去几十年中，研究人员探索了各种传递系统以克服这些挑战并增强mRNA疫苗的有效性。

最早的方法之一是使用裸mRNA分子，它们直接注射到细胞或组织中。在这里，mRNA在没有载体的情况下传递，允许其在细胞内被翻译成抗原蛋白。虽然裸mRNA疫苗相对容易生产并且在临床前研究中显示出前景，但它们的稳定性较差，并且可能比使用载体传递的mRNA疫苗引发较弱的免疫反应。另一种早期方法是mRNA-DC疫苗，它涉及将编码所需抗原的mRNA加载到DCs中。然后DCs向免疫系统呈现抗原，导致强大的免疫反应。这种方法在临床前研究中用于癌症和传染病治疗显示出前景。近年来，基于脂质的纳米颗粒(LNPs)和polyplexes/聚合物纳米颗粒已成为最常用的两种mRNA疫苗传递系统。

LNPs作为mRNA疫苗的传递系统被广泛使用，因为它们的生物相容性、稳定性以及保护mRNA免受降解的能力。LNPs可以根据它们的脂质成分、表面电荷和表面修饰进行分类。一类是阳离子LNPs，带正电荷的脂质成分与mRNA的带负电荷的磷酸骨架相互作用，促进后者进入目标细胞。以前的研究提供了离子化LNPs疫苗针对不同传染病的有效性的证据。离子化LNPs作为基于mRNA的疫苗的传递工具具有巨大潜力。这些纳米颗粒由一个mRNA中心核心组成，由一个脂质双层包围，该双层包含离子化脂质，允许有效的mRNA封装和保护免受细胞外环境的降解。此外，离子化脂质在促进mRNA货物的内质网释放和细胞质运输方面起着关键作用，这对于有效的蛋白质表达至关重要。聚乙二醇(PEG)化的LNPs在其表面具有PEG的亲水涂层，这增强了生物相容性并降低了毒性。

Polyplexes和聚合物纳米颗粒是多功能的传递系统，已经广泛研究用于mRNA疫苗。Polyplexes是通过带正电荷的聚合物（如聚乙烯亚胺）和带负电荷的mRNA分子之间的静电相互作用形成的。这些有效地保护mRNA免受降解，促进细胞摄取并增强免疫原性，由于它们的阳离子电荷。聚合物纳米颗粒可以由各种聚合物形成，包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和PEG，mRNA可以通过多种机制封装，涉及静电相互作用、疏水相互作用和共价键合。这些比polyplexes和LNPs具有更低的免疫原性和毒性，并且可以被设计以增强它们的稳定性和靶向特异性。然而，它们的转染效率可能低于LNPs，并且它们的生产可能更复杂和成本更高。

总的来说，传递系统的选择取决于几个因素，包括mRNA疫苗的特定特性和所需的转染效率、安全性、稳定性和靶向特异性。

2.4.mRNA疫苗佐剂

免疫原性调节是mRNA疫苗开发中不可忽视的问题。尽管体外转录的mRNA已经显示出一些自我佐剂潜力，但这通常不足以引发全面的保护性免疫，并且需要加强重复/加强方案以获得最佳效果。已经应用了多种策略用于mRNA疫苗的佐剂以调节其免疫原性。TriMix是一种编码三种不同免疫刺激蛋白的mRNA组合：CD40配体（CD40L）、CD70以及组成型活性Toll样受体4（TLR4）。由于其能够改善DC激活并增强CD8+ T细胞反应的诱导，TriMix已经被纳入了许多疫苗研究中。此外，阳离子脂质的使用被广泛认可，因为它能够改善RNA的摄取并促进其内质网逃逸，从而增加mRNA疫苗的佐剂活性。此外，合成mRNA序列与聚合物载体的结合已被证明可以增强各种亚单位疫苗的佐剂性。CureVac开发了RNActive®疫苗，通过结合天然存在的核苷酸和鱼精蛋白，表现出固有的自我佐剂活性。这种mRNA构建物的共同传递已被证明可以显著增强B和T细胞反应以及亚群（例如，Th1和Th2细胞）和前生发中心B细胞的放大。然而，这些策略的佐剂特性通常激活I型干扰素（IFN-I），这可能会导致蛋白质翻译的抑制以及CD8+ T细胞激活。为了克服这个限制，已经开发了一种由聚乳酸-羟基乙酸共聚物核心和脂质壳组成的混合纳米颗粒系统，用于同时传递mRNA和一种疏水性TLR7佐剂（gardiquimod）。聚乳酸-羟基乙酸共聚物促进了佐剂在细胞核内的整合，而脂质壳通过静电相互作用使mRNA装载成为可能。这种方法已经显示出针对特定抗原的强大免疫反应和高效的抗肿瘤活性。

3.mRNA疫苗在传染病中的应用

mRNA疫苗通过编码疾病特异性抗原，被应用于预防传染病。迄今为止，在包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）、寨卡病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、水痘-带状疱疹病毒和狂犬病病毒等多种传染病中，已进行了许多使用mRNA疫苗诱导抗病毒免疫的临床前和临床试验（表1和图3）。

表1. 传染病中mRNA疫苗的临床试验

图3 传染病中mRNA疫苗的概况。迄今为止，已经开发了针对多种传染病的mRNA疫苗，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）、寨卡病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、流感病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、水痘-带状疱疹病毒和狂犬病病毒。这个图形是使用Adobe Illustrator创建的，并整合了基于当前文献的知识。

3.1.针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2的mRNA疫苗

自2021年初以来，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）已经感染了无数人，并在全球造成了数百万人死亡。大多数SARS-CoV-2感染对于没有基础疾病的人来说并不构成生命威胁；然而，在严重感染的情况下，可能会在肺部引发不受控制的免疫反应，破坏上皮细胞和肺泡，引起肺水肿、危险的血管通透性增加和死亡。位于SARS-CoV-2表面的刺突蛋白通过与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2受体结合，促进病毒进入宿主细胞。因此，刺突蛋白是针对2019冠状病毒病（COVID-19）的mRNA疫苗编码受体结合域或全长刺突蛋白的主要靶标。迄今为止，已有两款针对冠状病毒刺突蛋白设计的mRNA疫苗获得批准，并在全球范围内广泛使用。这些疫苗包括Moderna开发的mRNA-1273和BioNTech/Pfizer开发的BNT162b2。与此同时，还有几种针对刺突蛋白的mRNA疫苗目前正在进行临床试验，以评估它们的安全性和有效性。

针对COVID-19疫苗的I期临床研究是在Moderna开发的mRNA-1273上进行的。在LNPs配方中，使用了电离脂质SM-102来封装修饰过的mRNA。mRNA序列通过N1-甲基伪尿苷进行修饰，编码具有两个脯氨酸替代物（S-2P）的SARS-CoV-2刺突蛋白，这诱导了前融合构象。Corbett等人在2020年进行的研究表明，mRNA-1273的给药在临床前模型中触发了针对原始和突变型（D614G）SARS-CoV-2的强效体液和细胞免疫反应。疫苗的给药有效地为小鼠提供了保护，防止了SARS-CoV-2在鼻腔和肺部的感染，且在呼吸系统中没有明显的不良影响或病理变化。2020年7月进行的随后的I期临床试验验证了mRNA-1273在人类中的安全性和有效性。第二次接种后抗S-2P中和抗体的几何平均滴度分别为299,751、782,719和1,192,154，分别接受了25μg、100μg或250μg的mRNA-1273，表明参与者中产生了强大的体液免疫反应。还检测到了强大的T细胞介导的细胞因子反应。接种疫苗后报告的大多数不良事件性质轻微至中度。这些包括头痛、寒战、注射部位疼痛、疲劳和肌痛等症状，超过一半的参与者经历了这些影响。接受250μg剂量的患者出现严重不良事件的比例更高（21%），特别是在第二次接种疫苗时。2020年9月，老年人也参与了试验，没有观察到限制试验的不良效果。III期随机、安慰剂对照研究于2020年7月至12月在美国的多个医疗中心进行，涉及30,420名志愿者，结果显示在对照组中有185名参与者被诊断出SARS-CoV-2感染，而接种疫苗的组中只有11名患者被诊断出感染。mRNA-1273对SARS-CoV-2感染显示出94.1%的有效性，对严重COVID-19疾病的有效性达到100%，由mRNA-1273引起的局部和全身反应短暂且轻微。2022年，Creech等人在II/III期试验中对6至11岁的儿童进行了mRNA-1273的评估。在试验的第一阶段，751名儿童接受了50μg或100μg剂量的mRNA-1273疫苗。基于安全性和免疫原性的结果，选择了50μg剂量水平用于试验的第二阶段。试验的第二阶段涉及将mRNA-1273（每次50μg）或安慰剂的两次注射随机给予4,016名儿童，然后对这些参与者在第一次注射后平均82天进行监测。在这个剂量水平上，观察到的不良事件主要是轻度和暂时的，注射部位疼痛、头痛和疲劳是最常报告的。截至数据截止日期，没有报告与疫苗相关的严重副作用，如多系统炎症综合征、心肌炎或心包炎。在第二次注射后1个月，接受50μg水平mRNA-1273的儿童显示出1610的中和抗体滴度，而接受100μg水平的年轻成年人的滴度为1300。两个年龄组中至少99.0%的参与者观察到了血清学反应。在Delta为主要流行变体的时候，评估的疫苗有效性针对初次注射后14天或更长时间发生的COVID-19为88.0%。总体而言，mRNA-1273显示出有希望的抗COVID-19效果，显著保护个体免受COVID-19的侵害。

BNT162b1和BNT162b2是BioNTech和Pfizer开发的两种COVID-19 mRNA疫苗。这些疫苗被封装在LNPs中，并使用Acuitas Therapeutics的电离脂质ALC-0315进行配方。这些疫苗中的mRNA是核苷酸修饰的，所有尿苷都被N1-甲基伪尿苷替代，这增强了mRNA的翻译。BNT162b1编码分泌型S糖蛋白受体结合域（RBD）蛋白，而BNT162b2编码S-2P蛋白。相关的I期临床研究在2020年4月进行，不同组的健康参与者接受安慰剂或两种疫苗中的一种的两种剂量（10μg、20μg、30μg和100μg）的治疗，间隔21天。BNT162b1和BNT162b2都以剂量依赖性方式在体内产生了对病毒的强烈血清学反应，尤其是在第二次接种后。在第二次接种后14天，即第35天，检测到最高水平的中和抗体。尽管BNT162b1和BNT162b2都引发了强大且稳健的免疫反应，但与BNT162b1相比，BNT162b2与较低的系统性不良事件风险相关，特别是在老年参与者中，这导致选择BNT162b2用于涉及43,448名参与者的更广泛的III期临床研究，该研究从2020年4月至12月进行。共有21,720名参与者接受了BNT162b2，而21,728名参与者接受了安慰剂。结果显示，在接种疫苗的组中有8名患者被诊断出SARS-CoV-2感染，而在安慰剂组中有162名患者被发现感染，表明BNT162b2的有效性为95%。在感染的患者中，有10人病情严重，其中9人属于安慰剂组，1人属于接种疫苗的组。此外，BNT162b2疫苗接种在人类中引发了强烈且持久的T滤泡辅助细胞反应。在Muik等人于2022年进行的一项研究中，测试了接受两剂或三剂BNT162b2疫苗的51个人的血清对原始型、Beta、Delta或Omicron假病毒的中和效果。在接种两剂后，针对Omicron变体的中和滴度比针对野生型的滴度降低了22倍以上。在接种第三剂疫苗一个月后，针对Omicron变体的中和滴度比两剂后的滴度提高了23倍，与接种两剂后观察到的针对原始型的中和滴度水平相似。总体而言，BNT162b2与卓越的安全性相关，并显示出针对COVID-19的强大效率，即使在变体的背景下也有效。

多项试验比较了mRNA-1273和BNT162b2疫苗的有效性。在Wang等人于2022年进行的一项研究中，比较了在Delta变异株占主导期间，mRNA-1273和BNT162b2疫苗在突破性SARS-CoV-2感染、住院和死亡方面的效果。BNT162b2组和mRNA-1273组的突破性感染月发病率从2021年7月到11月逐渐增加。然而，BNT162b2组的发病率高于mRNA-1273组。具体来说，在11月，BNT162b2组的发病率达到了每1000人天2.8例，而mRNA-1273组为每1000人天1.6例。进行匹配分析后发现，由62584人组成的mRNA-1273组相对于BNT162b2组（也包括62584人）表现出明显降低的突破性感染风险。在经历突破性感染的患者中，接受mRNA-1273疫苗的个体通常比接受BNT162b2疫苗的个体年龄更大。在性别、种族和民族构成以及合并症和不良社会健康决定因素方面也存在差异。进行匹配分析后，这些差异不再具有统计学意义。在接受mRNA-1273疫苗的个体中，60天住院风险为12.7%，有392名接受者需要住院。相比之下，在接受BNT162b2疫苗的个体中，60天住院风险略高，为13.3%，有2489名接受者需要住院。在死亡率方面，mRNA-1273接受者的60天死亡率为1.14%，有35人中的3078人死亡。对于BNT162b2接受者，60天死亡率为1.10%，有18737人中的207人死亡。在每组由3054人组成的匹配队列中，mRNA-1273疫苗的接受者与BNT162b2疫苗的接受者相比，显示出降低的60天住院风险。同样，Dickerman等人进行的一项研究检查了BNT162b2和mRNA-1273疫苗在美国退伍军人群体中的有效性。每个疫苗组由219842人组成。在24周的随访期间，以alpha变异株为主导，评估的记录感染风险在BNT162b2组为每1000人5.75例，在mRNA-1273组为每1000人4.52例。与mRNA-1273相比，BNT162b2每1000人额外的事件数量为：记录感染1.2例，有症状COVID-19 0.44例，因COVID-19住院0.55例，因COVID-19入住ICU 0.10例，以及因COVID-19死亡0.02例。在12周的随访期间，Delta变异株占主导，与mRNA-1273相比，BNT162b2的记录感染的相对过量风险为每1000人6.54例。总体而言，与接受mRNA-1273疫苗的人相比，接受BNT162b2疫苗的人表现出较低的症状、住院、ICU入院和死亡率，尽管感染率更高。

已开展多项研究，探讨mRNA-1273或BNT162b2在SARS-CoV-2变种背景下的使用情况。mRNA-1273和BNT162b2疫苗都显示出记忆B细胞反应的增强效力和广度，有效触发针对SARS-CoV-2 Omicron变种的中和免疫。Fabiani等人进行了一项研究，评估了mRNA疫苗的有效性以及针对SARS-CoV-2感染和严重COVID-19的逐渐减弱的保护，在33250344名16岁及以上的个体中，他们接受了BNT162b2或mRNA-1273疫苗的初始剂量，并在意大利显示没有更好的SARS-CoV-2感染诊断。在以Delta变异株盛行的时期，疫苗针对SARS-CoV-2感染的有效性从第二剂后的3-4周的82%显著下降到27-30周的33%。在同一时间段，疫苗针对严重COVID-19的有效性也有所下降，尽管下降幅度不那么明显，从96%下降到80%。在疫苗第二剂后27-30周，包括80岁及以上和60-79岁的高风险个体在内的个体，似乎没有得到足够的保护以防止感染。Abu-Raddad等人研究了mRNA疫苗加强剂对卡塔尔2239193名接受至少两剂BNT162b2或mRNA-1273疫苗的个体的SARS-CoV-2 Omicron感染的影响。在35天的随访后，接受BNT162b2疫苗的个体中，有症状的Omicron感染的累积发病率为加强组2.4%，非加强组4.5%。加强剂量在预防有症状的Omicron感染方面的有效性，与最初的初级系列相比，被确定为49.4%。加强剂量在减少因Omicron感染导致的COVID-19相关住院和死亡方面的有效性，与最初的疫苗系列相比，估计为76.5%。BNT162b2加强剂量在减少与Delta变种相关的有症状感染方面的有效性，与最初的疫苗系列相比，估计为86.1%。在接受mRNA-1273疫苗的个体中，加强组的有症状Omicron感染的累积发病率为1.0%，非加强组为1.9%。mRNA-1273加强剂量在减少有症状的Omicron感染方面的有效性，与初级疫苗系列相比，估计为47.3%。此外，Accorsi等人调查了3剂BNT162b2或mRNA-1273与由SARS-CoV-2 Omicron和Delta变种引起的有症状感染之间的关系。在报告的病例中，18.6%（n = 2441）的Omicron病例，6.6%（n = 679）的Delta病例和39.7%（n = 18587）的对照组接受了3剂mRNA疫苗。此外，55.3%（n = 7245）的病例，44.4%（n = 4570）的Delta病例和41.6%（n = 19456）的对照组接受了2剂mRNA疫苗。最后，26.0%（n = 3412）的病例，49.0%（n = 5044）的Delta病例和18.6%（n = 8721）的对照组报告未接种疫苗。在调整相关因素后，与未接种疫苗相比，接受三剂疫苗的优势比为Omicron病例0.33，Delta病例0.065。同样，与两剂疫苗相比，三剂疫苗的优势比为Omicron病例0.34，Delta病例0.16。Grewal等人进行了一项研究，估计第四剂相对于第三剂的边际有效性，以及BNT162b2和mRNA-1273针对任何感染、有症状感染和与Omicron变种相关的严重结果（住院或死亡）的总体疫苗有效性。将第四剂疫苗（95%的接受者接受mRNA-1273）在接种后7天或更长时间与84天或更早之前接受的第三剂进行比较，边际有效性估计为对任何感染19%，对有症状感染31%，对严重结果（住院或死亡）40%。与未接种疫苗的个体相比，接种疫苗的个体的有效性随着每增加一剂而逐渐增加。具体来说，对于第四剂，有效性观察为对整体感染49%，对有症状感染69%，对严重结果86%。Lauring等人评估了BNT162b2和mRNA-1273疫苗针对由Omicron、Delta和Alpha变种引起的COVID-19的临床严重性和有效性。研究涉及美国5728名COVID-19患者和5962名非COVID-19个体。在接受两剂疫苗的个体中，Alpha变种的比率为85%，Delta变种85%，Omicron变种65%。在接受三剂疫苗的个体中，Delta变种的比率为94%，Omicron变种86%。住院患者的院内死亡率为Alpha 7.6%（81/1060），Delta 12.2%（461/3788），Omicron 7.1%（40/565）。对于住院的未接种疫苗的COVID-19患者，疾病的严重程度，由WHO临床进展量表测量，发现Delta变种比Alpha变种升高，调整后的比例比值为1.28。相反，与Delta变种相比，Omicron变种的疾病严重程度较低，调整后的比例比值为0.61。与未接种疫苗的患者相比，接种疫苗的患者每种变种的疾病严重程度都较低，包括Alpha变种（调整后的比例比值0.33）、Delta变种（0.44）和Omicron变种（0.61）。总体而言，mRNA-1273和BNT162b2疫苗在COVID-19的预防和治疗中都显示出了保护效果，BNT162b2在对抗COVID-19变种方面显示出了更高的效力。尽管这种效果随时间推移会有所下降，但额外的加强剂量可以部分逆转这一现象，成为对抗COVID-19变种的一种策略。

2022年8月31日，美国食品药品监督管理局（FDA）更新了Moderna COVID-19疫苗和Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗的紧急使用授权，允许使用双价配方作为单一加强剂量。更新后的加强剂包括两个来自SARS-CoV-2病毒的mRNA元素。这些双价配方由病毒初始类型的一个组分和另一个属于奥密克戎变体BA.4和BA.5谱系的元素组成。建议在初次接种或之前加强疫苗接种后至少2个月进行加强剂的接种。Moderna COVID-19疫苗，双价型，已被批准作为18岁及以上个体的独立加强针。Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗，双价型，已被授权作为12岁及以上人群的单一加强剂量。FDA对大约600名18岁及以上的成年人进行了免疫反应数据的评估，这些人已经接受了两剂主要系列疫苗和一剂额外的单价Moderna COVID-19疫苗加强剂量。这些人在初次加强针后至少3个月接受了第二剂单价Moderna COVID-19疫苗或Moderna的实验性双价COVID-19疫苗，该疫苗包括原始毒株和BA.1奥密克戎变体。在28天后，接受双价疫苗的群体显示出对BA.1奥密克戎变体的免疫反应优于接受单价Moderna COVID-19疫苗的群体。由于双价（原始和奥密克戎BA.1）和单价Moderna COVID-19疫苗使用相同的工艺制造，从双价疫苗获得的安全性数据是相关且适用于单价Moderna COVID-19疫苗的。为了评估Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗，双价型，作为12岁及以上个体的单一加强剂量的有效性，FDA检查了大约600名55岁以上的个体的免疫反应数据，这些人之前接受了两剂主要系列疫苗和一剂使用单价Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗的额外加强剂量。这些人在初次加强剂量后4.7至13.1个月之间接受了第二剂单价Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗或Pfizer-BioNTech的实验性双价COVID-19疫苗，该疫苗包括原始毒株和BA.1奥密克戎变体。1个月后，接受双价疫苗的群体对BA.1奥密克戎变体的免疫反应被发现优于接受单价Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗的群体。由于双价疫苗和单价疫苗使用相同的工艺制造，安全性数据与Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗相关。在此次批准之后，FDA修订了Moderna COVID-19疫苗和Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗的紧急使用授权，取消了在18岁及以上和12岁及以上人群中使用单价Moderna和Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗作为加强剂量的使用。这些单价疫苗仍然被授权作为6个月及以上个体的主要系列疫苗，如其各自的授权信中所述。Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗目前被授权用于5至11岁人群的单一加强剂量，至少在完成Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗的主要系列后5个月。总体而言，双价疫苗代表了针对COVID-19的mRNA疫苗的新步骤。

mRNA疫苗的一个问题是它需要极低温度的储存，这限制了其在条件差和经济水平低的地区的应用。CVnCoV是由CureVac AG开发的未经化学修饰的mRNA疫苗，编码S-2P，至少在+5°C下稳定3个月，并于2020年4月首次报告。使用CVnCoV的临床前模型显示，这种疫苗诱导了强大的体液反应以及强烈的T细胞反应，有效诱导了IFN-γ+ TNF+ T细胞。此外，在接种后4周感染SARS-CoV-2的动物在10μg剂量下在下呼吸道没有检测到病毒。而且，CVnCoV减少了感染SARS-CoV-2的小鼠肺部的组织病理变化。2020年6月进行的I期临床试验表明，接种两剂CVnCoV的个体是安全且耐受性良好的。CVnCoV显著增加了S-蛋白以及RBD的IgG抗体水平，并且两个12μg剂量的CVnCoV后的中位抗体滴度与COVID-19患者的血清中相似。因此，选择了12μg剂量进行II/III期试验。2020年12月至2021年4月在全球47个中心进行的随机IIb/III期临床试验。经过40多天的观察，在CVnCoV组的12851人中有83人被诊断出SAR-CoV-2感染，在安慰剂组的12211人中有145人被诊断出SAR-CoV-2感染；整体疫苗效力仅为48.2%，部分原因是SARS-CoV-2变体的存在。同年，CureVac AG宣布了其第二代mRNA疫苗CV2CoV，它具有优化的非编码区域以提高目标抗原的水平。CV2CoV在非人类灵长类动物中比CVnCoV诱导了更高滴度的中和抗体和更强的T细胞反应。此外，挑战试验的结果显示CV2CoV在上呼吸道和下呼吸道中诱导了更强的保护和更低的病毒载量。临床试验已经计划并在不久的将来进行。ARCoV是由Abogen在2020年开发的LNP mRNA疫苗，编码RBD蛋白。ARCoV mRNA-LNP在临床前小鼠模型中触发了高滴度的中和抗体和对SARS-CoV-2的强烈T细胞反应，显著增加了病毒特异性CD4+和CD8+ T细胞分泌的IFN-γ和TNF-α。进一步感染SARS-CoV-2的疫苗接种小鼠显示ARCoV保护小鼠免受SARS-CoV-2感染，接种小鼠的肺部没有可测量的病毒RNA。在非人类灵长类动物模型中接种两剂ARCoV触发了强大的体液反应，其特征是提高的中和抗体滴度和对SARS-CoV-2的强烈细胞反应。挑战试验揭示了所有接种疫苗的猕猴的气管和肺叶中没有可检测到的病毒小导向RNA，而接受安慰剂治疗的猕猴存在强烈的病毒复制。这些结果表明ARCoV能够防止SARS-CoV-2在下呼吸道的复制。2021年4月在印度尼西亚和墨西哥的多个中心启动了III期临床研究（NCT04847102）。需要进一步的临床结果来评估这种mRNA疫苗的有效性。

LUNAR-COV19是由Arcturus在2020年开发的自复制mRNA疫苗，编码S-2P抗原，旨在通过单次低剂量给药提供强大的免疫力。LUNAR-COV19在临床前模型中诱导了强大的T细胞反应，扩大了CD44+CD62L-效应/记忆亚群，增强了IFN-γ+ CD8+/CD4+ T细胞的比例，以及产生了高滴度的中和抗体的强大体液反应。接种10mg LUNAR-COV19的80%的小鼠在接种后30天显示出PRNT50滴度>320。使用人类ACE2转基因C57BL/6小鼠模型进行挑战试验，接种后感染原始型SARS-CoV-2的小鼠体重没有变化，也没有临床症状，而接受安慰剂的小鼠感染后临床评分增加，体重显著下降。病毒载量的评估显示，与接受安慰剂治疗的小鼠相比，接种疫苗的小鼠的两个肺部都没有检测到SARS-CoV-2 RNA。LUNAR-COV19在II期临床研究（NCT04480957）中使用，耐受性良好，并观察到注册患者中中和抗体水平的增加。需要进一步的研究来推广这种疫苗的应用。

总的来说，mRNA疫苗的批准不仅保护了众多个体免受COVID-19的侵害，也为针对其他疾病的mRNA疫苗的开发提供了宝贵的经验。值得注意的是，尽管已经制备并使用了多种抗SARS-CoV-2 mRNA疫苗，但仍有未解决的问题，作用机制仍不清楚。例如，mRNA疫苗在人类中提供对COVID-19的保护的持续时间，以及如何增加主要保护上呼吸道的IgA抗体水平，目前尚不清楚。如何降低不良反应的发生率，因为mRNA疫苗引起的系统性不良事件的发生率仍然高于灭活病毒疫苗或蛋白质亚单位疫苗，正如以前的临床试验所证明的。长期监测可能会提供更详细和有用的信息，从而安全和广泛地应用mRNA疫苗。

3.2.针对寨卡病毒的mRNA疫苗

寨卡病毒（ZIKV）是一种具有正义单链RNA基因组的RNA病毒，长度为11千碱基。感染ZIKV的人通常会发展出持续两到七天的发热、头痛、皮疹、不适和结膜炎。然而，它对祖细胞的嗜性会在少数情况下引起神经发育出生缺陷和先天性畸形。预防性疫苗接种是针对ZIKV感染并发症的唯一选择，因为目前没有针对这种病毒的药物。膜和包膜蛋白是针对ZIKV的mRNA疫苗的常见抗原。迄今为止，已有几种基于mRNA平台开发的ZIKV疫苗在临床前模型中进行了测试。2017年，Pardi等人设计了一种包含膜和包膜糖蛋白的LNP封装mRNA疫苗。在C57BL/6小鼠中接种30微克mRNA疫苗引发了强大的免疫反应，没有炎症或其他不良事件。ZIKV报告病毒颗粒检测显示，接种疫苗后8周的平均中和IgG对ZIKV病毒达到峰值，并在接种后12周保持稳定。还观察到强烈的E蛋白特异性CD4+ T细胞反应，这通过IL-2、TNF-α和IFN-γ的稳健细胞内产生得到证实。此外，挑战研究表明，接种mRNA疫苗的小鼠和非人类灵长类动物显示出对ZIKV感染的保护。同年，Richner等人开发了一种包含原始类型和变体ZIKV膜糖蛋白的LNP封装mRNA疫苗。两剂mRNA疫苗增强了血清中和反应对ZIKV，并保护小鼠免受ZIKV感染。还在小鼠妊娠模型中评估了mRNA疫苗的有效性。接种疫苗的小鼠在胚胎第六天感染ZIKV，结果显示两剂mRNA疫苗显著降低了胎儿和胎盘组织中的病毒RNA水平。尽管mRNA ZIKV疫苗在临床前研究中的结果很有希望，但还需要进一步的人类临床试验。然而，针对这些疫苗在孕妇中的临床试验因伦理问题而受到削弱。

3.3.针对人类免疫缺陷病毒的mRNA疫苗

人类免疫缺陷病毒（HIV）是逆转录病毒科慢病毒属的成员，分为两种类型：HIV-1和HIV-2。HIV引起获得性免疫缺陷综合症（AIDS），全球约有7500万人感染，造成超过3200万与AIDS相关的死亡（来自2019年全球HIV和AIDS统计数据）。尽管进行了30年的研究，但由于HIV包膜中发现的蛋白质具有显著的抗原多样性和密集的“糖盾”，隐藏了关键包膜蛋白的表位，因此尚无有效的预防疫苗。迄今为止，已经在临床研究中调查了多种mRNA疫苗。2016年，Gandhi等人使用mRNA转染的自体DCs来刺激对HIV-1的免疫反应。共有15名患者参与试验，并随机分配到两个单独的组，分别接受编码HIV-1抗原的DC mRNA疫苗或安慰剂。DC mRNA疫苗显著增强了CD4+ T细胞对HIV-1 Gag的增殖反应，与接受安慰剂的参与者相比增加了3.4倍。然而，没有检测到IFN-γ的显著释放，CD8+ T细胞增殖反应的增加是短暂的。110 2017年，Jong等人基于针对HIV的有效抗病毒T细胞反应的保守靶标开发了一种HIV mRNA免疫原。使用这种疫苗的I期试验显示，随着剂量的增加，它是安全且耐受性良好的。尽管这些发现令人鼓舞，但由于疫苗产生的免疫原性不足，同年的II期临床研究被停止。2020年，Gay等人将AGS-004（一种DC mRNA疫苗）与潜伏期逆转剂vorinostat结合使用，并评估了对HIV储库的影响。这种组合疗法的目的是通过对vorinostat破坏病毒学潜伏期，并通过mRNA疫苗耗尽表达HIV抗原的细胞并清除HIV储库。然而，尽管AGS-004和vorinostat的组合是安全且耐受性良好的，但对HIV的免疫反应没有显著影响，所有参与者在整个治疗期间休息的CD4+ T细胞感染频率保持稳定。一种同时表达膜锚定HIV-1包膜（Env）和猴免疫缺陷病毒（SIV）Gag蛋白的mRNA疫苗被创建以产生病毒样颗粒。这种疫苗配方引发了对HIV-1具有广泛中和能力的抗体的产生，并在恒河猴中显示出感染风险的降低。首先用含有缺乏N276糖基的传播者克隆B env蛋白的mRNA疫苗对恒河猴进行初次免疫。使用修复了缺失糖基的自体Envs对恒河猴进行了多次增强免疫，随后使用来自A和C克隆的双价异源Envs。所描述的疫苗方案在诱导强烈的免疫反应方面非常有效，导致产生了针对最普遍（tier-2）HIV-1菌株的中和抗体和强大的抗Env CD4+ T细胞反应。在进行多次低剂量粘膜挑战后，接种疫苗的动物表现出每次暴露风险降低79%。这些发现表明，多克隆Env-Gag病毒样颗粒mRNA平台作为开发HIV-1疫苗的潜在方法具有前景。值得注意的是，一家生物技术公司与非营利合作伙伴IAVI（国际艾滋病疫苗倡议）合作，已经开始了一项针对研究性mRNA HIV疫苗的I期临床试验（https://investors.modernatx.com/news/news-details/2022/IAVI-and-Moderna-Launch-Trial-of-HIV-Vaccine-Antigens-Delivered-Through-mRNA-Technology/default.aspx）。该疫苗候选物采用了主要和增强策略，以引发目标B细胞反应，目的是产生针对HIV的广泛中和抗体。疫苗中使用的抗原是由IAVI的科学家作为蛋白质开发的。他们之前在一种佐剂蛋白基础疫苗中调查了主要抗原，该疫苗在97%的试验参与者中诱导了所需的B细胞反应。值得注意的是，mRNA HIV疫苗的开发仍处于初期阶段。需要更多的研究来优化这种治疗策略，以实现持久的免疫反应。研究集中在同时给予药物，以帮助重新激活HIV储库，使其对免疫系统可见，并可能最终提高mRNA HIV疫苗的有效性。

3.4.针对流感病毒的mRNA疫苗

流感病毒是正黏液病毒科的成员，主要由四种类型的流感病毒组成：A型、B型、C型和D型；其中，A型和B型与人类疾病有关。mRNA疫苗针对流感病毒的典型靶标是病毒表面的糖蛋白血凝素（HA），因为它介导病毒进入。然而，由于流感病毒的快速变异，导致抗原漂移，mRNA疫苗的HA抗原成分需要每年审查和修改。这一特性使mRNA疫苗成为预防流感病毒感染和控制疾病传播的最适宜平台。2012年，Petsch等人通过证明针对编码流感A/波多黎各/8/1934（PR8HA）全长HA的mRNA疫苗的有效性，取得了重大突破。接种mRNA疫苗的小鼠血清显示有效的血清转换，增加了病毒中和抗体的数量。此外，接种疫苗的小鼠的CD8+ T细胞增加了与病毒清除和长期免疫记忆相关的细胞毒性活性。mRNA疫苗的接种还诱导了长期免疫，并保护了动物（小鼠、雪貂和猪）免受流感A病毒感染。值得注意的是，编码PR8 H1N1株HA的mRNA疫苗触发了针对H1N1和H5N1株的同源和异源免疫反应，表明对异质性病毒的保护。2017年，Lutz等人开发了一种包含流感病毒株H1N1pdm09 HA的LNP封装mRNA疫苗。使用mRNA疫苗诱导了增强的适应性免疫反应，表现为短暂的局部免疫刺激环境。接种疫苗的小鼠血清显示增加了特异性针对流感病毒的多功能CD4+和CD8+ T细胞的数量。mRNA疫苗的注射在至少一年内诱导了稳定的体液反应，与其他基于灭活病毒的许可疫苗相当，这通过持续的功能抗体和T细胞反应的跟踪得到证明。同年，Bahl等人开发了编码H10N8和H7N9的HA蛋白的mRNA疫苗，这些疫苗在临床前小鼠模型中诱导了强大的体液和细胞反应，保护小鼠免受致命感染。Feldman等人进一步进行了首次随机I期临床试验，使用两种针对H10N8和H7N9的mRNA疫苗。这两种疫苗耐受性良好，没有严重的疫苗相关不良事件。50微克mRNA疫苗皮内注射后的HA抑制滴度在89.7%的患者中≥1:40。然而，没有检测到显著增强的细胞反应。2021年，Chivukula等人使用了未修饰和LNP封装的mRNA，编码全长HA或全长神经氨酸酶（NA）。HA和NA mRNA-LNP配方，无论是作为单价还是多价疫苗接种，都已证明能够在非人类灵长类动物中引发强大的功能性抗体和细胞免疫反应。诱导的抗原特异性抗体反应已发现与小鼠对病毒挑战的保护效果相关。2022年，McMahon等人评估了针对流感的四价核苷修饰mRNA疫苗的免疫原性和保护效力。这种疫苗配方包括来自流感A组2病毒的四种抗原：HA茎、NA、基质蛋白2和核蛋白。接种引发了针对所有挑战病毒的抗原特异性细胞和体液免疫，保护小鼠免受所有挑战病毒的侵害，并在每抗原125纳克的剂量下提供对病态的保护。同年，Pardi等人开发了一种五价核苷修饰mRNA疫苗，提供针对流感B病毒的广泛保护，编码抗原，B/Yamagata/16/1988-like谱系HA，B/Victoria/2/1987-like谱系HA，NA，基质-2和核蛋白。这种疫苗在每抗原50纳克的极低剂量下提供了对病态的保护。此外，Arevalo等人开发了一种针对所有已知流感病毒亚型的多价核苷修饰mRNA疫苗。这种多价疫苗编码了所有20种已知的流感A/B病毒谱系的HA抗原，在小鼠和雪貂中引发了强烈的抗体反应。这些抗体对所有20种编码的抗原显示出反应性，并在小鼠和雪貂受到匹配和不匹配的病毒株挑战时提供了保护。总的来说，生产速度快的mRNA疫苗可能成为对抗流感病毒的关键治疗手段。需要进一步的随机研究来确认mRNA流感疫苗的安全性和有效性。

3.5.针对巨细胞病毒的mRNA疫苗

人类巨细胞病毒（CMV）属于β疱疹病毒亚科，具有236千碱基的基因组大小。初次感染后，CMV通常建立潜伏状态，在宿主中持续存在而不引起活跃疾病。免疫受损个体中的病毒再激活可能导致涉及肺、胃肠道、肝脏、眼睛或中枢神经系统的危及生命的并发症。CMV被认为是先天性畸形的最普遍感染原因，10-15%的病例中有感音神经性听力损失、发育迟缓和胎儿死亡。病毒进入宿主细胞的过程是通过病毒包膜糖蛋白（g）gB和gH/gL（五聚体复合物（PC））的存在来促进的，细胞−细胞融合事件允许病毒的传播。2018年，John等人开发了一种编码多种CMV抗原的mRNA疫苗，体外细胞实验的结果表明，mRNA转染的细胞表达了高水平的编码抗原。在小鼠中接种mRNA CMV疫苗产生了针对gB和PC的持久和高滴度的中和抗体。此外，在接种疫苗的小鼠中观察到IFN-γ产生T细胞的比例增加。2020年，Nelson等人在兔子中测试了一种编码全长gB的mRNA疫苗，与其他接种组相比，显示了增强的病毒中和能力和更优越的全病毒吞噬活性。持久的免疫反应鼓励这种mRNA疫苗在未来的临床研究中使用。2021年，Webster等人通过肌肉注射给猕猴和恒河猴接种了编码CMV gB和PC的mRNA疫苗，在两种物种中都检测到了针对抗原的血浆抗体水平的增加。针对PC的抗体是剂量依赖性的，而针对gB的增强抗体在接受20微克疫苗和120微克疫苗的组中相似。然而，mRNA对抗体诱导的CMV细胞吞噬没有显著影响。两项I期临床试验正在进行中，但不招募，以评估mRNA-1647 CMV疫苗的反应原性、安全性和免疫原性（NCT05105048和NCT05397223）。一项II期临床试验正在招募中，以评估mRNA-1647 CMV疫苗的效力、安全性和免疫原性（NCT05683457）。一项I/II期临床研究也在招募中，以评估9至15岁健康个体和16至25岁个体中mRNA-1647 CMV疫苗的安全性和免疫原性（NCT05575492）。一项III期临床研究正在招募16至40岁的健康参与者，以评估mRNA-1647 CMV疫苗的效力、安全性和免疫原性（NCT05085366）。评估健康成人中mRNA-1647和mRNA-1443 CMV疫苗的安全性、反应原性以及免疫原性的I期试验已完成，但结果尚未披露（NCT03382405）。评估CMV疫苗mRNA-1647的安全性和免疫原性的剂量寻找研究也在健康成人中完成，但结果尚未报告（NCT04232280）。总的来说，到目前为止，还没有关于CMV mRNA疫苗的安全性、反应原性、安全性和免疫原性的临床数据被报告。这些数据的发布有可能为抗CMV mRNA疫苗的进步提供重要的见解。

3.6.针对呼吸道合胞病毒的mRNA疫苗

呼吸道合胞病毒（RSV）是副黏液病毒科肺病毒属的一种包膜病毒。它是婴幼儿急性下呼吸道感染最常见的病原体。免疫力低下的老年人也容易感染RSV。人体免疫系统针对RSV的融合蛋白（F蛋白）；因此，它通常被选为疫苗开发的抗原。然而，当RSV附着在目标细胞上时，F蛋白以融合前的形式发生改变，隐藏了有效的中和表位，导致RSV的免疫逃逸。2020年，Espeseth等人测试了编码不同构象RSV F蛋白的mRNA疫苗，结果表明，RSV F蛋白的天然形式产生了针对融合前和融合后特异性表位的高滴度中和抗体。编码具有融合前稳定突变的F蛋白的mRNA疫苗可以产生针对融合前特异性表位的体液反应。然而，稳定突变并没有与编码天然F蛋白的mRNA疫苗相比产生更高滴度的中和抗体或增强的T细胞反应。正在进行的I期研究正在招募5个月至24个月的个体，以评估mRNA-1365和mRNA-1345的安全性和免疫原性（NCT05743881）。目前正在进行的I期试验，重点关注mRNA-1345在不同人群中的耐受性和反应原性（NCT04528719）。这包括年轻人、育龄期妇女、老年人和RSV血清阳性儿童。该研究涉及不同的剂量方案，包括在年轻人中进行高达5个剂量水平的单次注射，在年轻人中进行3次中间剂量水平的注射，间隔56天，老年人在初次注射后约12个月进行增强注射，以及RSV血清阳性儿童进行3次1个或2个剂量水平的注射，间隔56天。尽管婴幼儿经常感染RSV，但迄今为止，这个阶段进行的临床试验很少，但已经为成年人启动了试验。Moderna开发了一种名为mRNA-1777的mRNA疫苗，编码在融合前构象中稳定的RSV F蛋白，成为首个进入I期临床研究的RSV mRNA疫苗，评估其安全性、耐受性和免疫原性。共有72名18至49岁的健康年轻人和107名60至79岁的健康老年人参加了这项研究，随机分为两组，接受mRNA-1777或安慰剂治疗。mRNA-1777的安全性概况良好，没有严重不良事件的报告，并观察到良好的耐受性。mRNA-1777诱导的中和抗体几何平均滴度在注射后第29天至60天达到峰值，并随时间下降。IFN-γ、IL-2和TNF-α的细胞内细胞因子染色也显示，年轻人和老年人参与者的CD4+ T细胞反应增强。这些结果对于将来在脆弱的成年人群中进行大型随机、安慰剂对照试验是很有希望的。此外，已经进行了多项临床试验。正在进行的I期研究正在招募50至75岁的成年人，以评估mRNA-1045 RSV疫苗的安全性、反应原性和免疫原性（NCT05585632）。一项观察性研究目前正在招募参与者，以评估Moderna mRNA-1345疫苗在预防RSV引起的下呼吸道感染方面的实际效果，并调查额外的健康和经济成果（NCT05572658）。正在进行的I/II期研究正在评估在18至50岁和60岁及以上的健康成年人中，单次肌肉注射3个剂量水平的RSV mRNA疫苗候选物与两种不同的LNPs（即，含有CL-0059或CL-0137的LNP）的安全性和免疫原性（NCT05639894）。正在进行的II/III期研究正在招募60岁及以上的成年人，以评估mRNA-1345疫苗的安全性和耐受性，以及疫苗预防这一人群中首次RSV相关下呼吸道感染发作的能力（NCT05127434）。尽管已经启动了多项临床研究，但几乎所有研究仍处于早期阶段，mRNA疫苗针对下呼吸道感染的预防效果仍有待确定。

3.7.针对水痘-带状疱疹病毒的mRNA疫苗

水痘-带状疱疹病毒（VZV），也称为人类疱疹病毒3，是一种具有双链DNA基因组的α疱疹病毒，在人类中广泛分布。原发性VZV感染导致水痘，并在神经节细胞中潜伏。在细胞免疫对VZV减少的严重情况下，潜伏的VZV会被重新激活，导致带状疱疹神经痛，这可能导致持续数月的难以忍受的疼痛，并影响患者的生活质量。VZV编码10种糖蛋白：ORFS/L、gK、gN、gC、gB、gH、gM、gL、gI和gE。2020年，Monslow等人开发了一种包含VZV gE抗原的LNP封装mRNA疫苗，并将其效果与市场上两种其他疫苗（一种为减毒活病毒，一种为亚单位蛋白）进行了比较。将恒河猴分为五组，并用不同剂量的VZV gE亚单位蛋白、减毒活VZV和mRNA VZV疫苗进行治疗。结果显示，两种50微克mRNA VZV疫苗的安全性以及其触发的体液和细胞免疫能力与50微克亚单位蛋白疫苗相当，表明mRNA疫苗是未来生产VZV疫苗的合适平台。尽管结果的转化前景很有希望，但仍然迫切需要更多的临床和临床前研究，重点关注疫苗的有效性和安全性。

3.8.针对狂犬病毒的mRNA疫苗

狂犬病毒是一种负链RNA病毒，属于弹状病毒科，导致狂犬病，这是一种几乎100%致死的人畜共患病毒性疾病。狂犬病毒通过表面糖蛋白RABV-G与其细胞靶标结合，进入外周神经和中枢神经系统。2016年，Schnee等人在小鼠和家猪中测试了一种由编码RABV-G的mRNA组成的疫苗，并发现2剂这种疫苗诱导了病毒特异性中和滴度≥0.5 IU/ml，并增加了病毒特异性CD4+ T细胞的比例。接种20微克和80微克mRNA疫苗的小鼠的抗体滴度在每月测量一次的一年内保持稳定，平均滴度约为40 IU/ml。接种疫苗的小鼠免受脑内狂犬病毒的感染，表明mRNA疫苗的免疫原性令人满意。2017年，Alberer等人在德国进行了首个使用mRNA狂犬病疫苗CV7201的I期临床研究。共有101名18至40岁的参与者入组并接种疫苗，结果表明CV7201总体上安全且耐受性良好，只有一种与疫苗相关的严重副作用（中度贝尔氏麻痹）。RABV-G特异性IgM和IgG滴度在注射后21天和42天达到峰值。在1年增强后，血清IgG显著增加，表明参与者建立了免疫记忆反应。RABV-G特异性CD4+ T细胞在接种疫苗后短暂增强，并在注射后3个月降至基线水平。由于使用mRNA狂犬病疫苗的I期临床试验显示出令人满意的结果，未来的研究应该专注于增加抗体滴度，诱导更长时间的免疫反应，以帮助生产更便宜、更可获得的狂犬病疫苗，以满足公共卫生的需要。

4.mRNA疫苗在癌症治疗中的应用

mRNA疫苗在癌症治疗中的应用通常是以治疗性的方式，而不是传染病的预防性方法。事实上，它通常被设计为编码肿瘤相关抗原（TAAs）或新抗原，以激活抗肿瘤免疫反应。迄今为止，已有多项临床试验在美国国家医学图书馆（ClinicalTrials.gov）注册，研究mRNA疫苗针对各种癌症的效果，包括黑色素瘤、脑癌、非小细胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌、前列腺癌、血液系统癌症、消化系统癌症和乳腺癌（表2和图4）。

表2. 癌症中mRNA疫苗的临床试验

图4 癌症中mRNA疫苗的概况。迄今为止，已经开发了针对多种癌症的mRNA疫苗，包括黑色素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、血液系统癌症、消化系统癌症和乳腺癌。这个图形是使用Adobe Illustrator创建的，并整合了基于当前文献的知识。

4.1.针对黑色素瘤的mRNA疫苗

黑色素瘤起源于广泛分布于身体各部位（例如皮肤、粘膜、葡萄膜、内耳和直肠）的黑色素细胞的恶性转化。皮肤黑色素瘤是最常见的类型，约占所有新诊断的原发性恶性肿瘤的1.7%，是全球所有癌症死亡率的0.7%。基于DC的mRNA疫苗主要用于对抗黑色素瘤。早在1996年，Boczkowski等人进行了采用mRNA脉冲化的DC转移，发现编码卵清蛋白（OVA）的DC脉冲化mRNA疫苗保护小鼠免受OVA表达的肿瘤细胞的侵害，并显著减少了B16/F10.9肿瘤模型中的肺转移。近年来，在黑色素瘤患者中测试了多种基于DC的mRNA疫苗。Gaudernack等人从活检的黑色素瘤组织中分离出自体总mRNA，并通过电穿孔将其引入DCs。然后，黑色素瘤患者接种了来自自体肿瘤mRNA转染的DCs，引发了一系列T细胞反应。几种抗原已被用作mRNA疫苗开发的靶标，如MAGE-A3、MAGE-A2、gp100和酪氨酸酶。MAGE-A3和MAGE-C2仅在生殖细胞和肿瘤细胞（包括黑色素瘤细胞）中表达，而酪氨酸酶和gp100在肿瘤和正常组织中广泛表达。Aarntzen等人利用mRNA电穿孔单核细胞衍生的DCs编码gp100和酪氨酸酶。然后这些单核细胞衍生的DCs被用于治疗45名III期和IV期黑色素瘤患者。研究表明，对肿瘤抗原有显著的CD4+和CD8+ T细胞反应，表明mRNA电穿孔DC疫苗治疗黑色素瘤的潜在有效性。

免疫学佐剂通常用于刺激和放大针对目标抗原的免疫反应，以调节mRNA疫苗的体内免疫原性。TriMix作为基于DC的mRNA疫苗主要用于黑色素瘤，因为它编码激活刺激因子CD40L（CD4+ T细胞激活因子）、共刺激分子CD70（CD8+ T细胞激活因子）和组成型激活的TLR 4（DC抗原呈递促进因子）。Wilgenhof等人描述了一项Ib期试验，招募了15名晚期黑色素瘤患者，他们接受了电穿孔合成mRNA（TriMixDC-MEL）的自体单核细胞衍生DCs的疫苗接种。报告显示mRNA编码CD40L、TLR4、CD70、HLA-II靶向信号和一种TAA（MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶或gp100）。接种疫苗后，两名患者表现出完全反应，两名患者表现出部分反应，所有表现出客观反应的患者都有超过两年的无进展疾病。此外，Jansen等人展示了使用TriMixDC-MEL作为III/IV期黑色素瘤辅助治疗的II期试验。研究分支的发现显示71%的患者一年后无病，相比之下对照组为35%。鉴于PD-1/PD-L1的表达可能会损害mRNA疫苗的激活效力，有一项研究调查了TriMixDC-MEL与免疫检查点抑制剂（ipilimumab）联合治疗III/IV期黑色素瘤的效果（NCT01302496）。治疗引发了客观的长期临床反应，5年随访后总生存率为28%（11/39），无进展生存率为18%（7/39）。80%（12/15）的免疫监测患者是疫苗反应者，其中10人至少对两种抗原表现出T细胞反应。

尽管基于体外转录的形式比基于DC的形式较少见，但分子生物技术的发展已使这种形式在癌症治疗中成为可行。BioNTech、GenenTech和Moderna是制药行业的领先公司，因此，它们已宣布了针对黑色素瘤的体外转录基础疫苗的临床更新。2004年，Weide等人进行了一项I/II期研究，评估了编码TAAs（gp100、Melan-A、酪氨酸酶、MAGE-A1、MAGE-A3和survivin）的精胺-mRNA疫苗在21名转移性黑色素瘤患者中的安全性和有效性。接种疫苗后，7名可测量疾病患者中有1名患者经历了完全反应。接种疫苗的患者外周血液中的Foxp3+/CD4+调节性T细胞或骨髓抑制细胞分别显著减少。4名可免疫学评估的患者中有2名显示出疫苗特异性T细胞的繁殖性升高。BNT111是一种编码四种TAAs的脂质体RNA疫苗，MAGE-A3、NY-ESO-1、PTEN和酪氨酸酶，其安全性和有效性在2015年静脉注射后的I期试验中进行了评估（Lipo-MERIT，NCT02410733）。本研究招募了89名患者，其中42名患有可测量的III/IV期黑色素瘤。BNT111单药治疗组中有3名患者表现出部分反应，7名患者表现出稳定疾病，1名患者通过PET/CT成像显示出转移性病变的完全代谢缓解。BNT111与PD-1阻断的联合治疗显示，17名患者中有6名经历了部分反应。在长达两年的随访期间，大多数部分反应或稳定疾病的患者的疾病在两组中都得到了长期控制。观察到的临床反应伴随着针对疫苗抗原的CD4+和CD8+ T细胞免疫反应的激活。此外，患者经历的治疗不良事件主要是轻度至中度的类似流感症状，如发热和寒战。这些症状大多在早期观察到，持续时间短，易于管理，通常在24小时内解决。目前，BNT111正在进行一项针对PD-1抑制剂难治性/复发性和不可切除的III/IV期黑色素瘤的II期试验（NCT04526899）。2021年11月19日，BioNTech的BNT111被FDA授予治疗黑色素瘤的优先资格。2022年，Sittplangkoon等人研究了编码不同水平N1-甲基伪尿苷修饰的肿瘤抗原的mRNA在B16黑色素瘤模型中的免疫原性和抗肿瘤反应。编码OVA的mRNA疫苗诱导了显著的IFN-I产生和DC成熟，随着N1-甲基伪尿苷修饰百分比的增加，观察到负相关。未修饰的OVA-LNPs显著减少了肿瘤生长，延长了生存，并在B16-OVA小鼠黑色素瘤模型中增加了肿瘤内CD40+ DCs和颗粒酶B+/IFN-g+/TNF-a+多能OVA肽特异性CD8+ T细胞的频率。未修饰的OVA-LNPs的强大抗肿瘤效果也在肺转移肿瘤模型中发现。此外，使用B16黑色素瘤新抗原（Pbk-Actn4）评估了mRNA疫苗，导致肿瘤生长延迟。此外，在2017年，Fernandez等人启动了一项I期试验，评估ECI006疫苗在黑色素瘤中的免疫原性和安全性（TriMix和编码TAA的mRNA的组合）（NCT03394937）。然而，上述mRNA疫苗旨在针对TAAs，中心耐受是不可避免的。因此，需要个性化的mRNA疫苗来克服这一挑战。

个性化RNA突变体疫苗在人类黑色素瘤中的初步应用在2017年被报道。作者通过对13名黑色素瘤患者的RNA和外显子测序，鉴定出非同义突变，并从中选择10个突变位点构建了两种合成RNA，这些RNA根据与HLA I/II类的亲和力进行选择。所有患者至少接受了8次，最多20次新表位疫苗注射。在之前对新表位反应较弱的患者中，观察到三分之一的患者反应增加，而其余患者观察到去新反应。在疫苗接种开始时没有放射学可检测病变的8名患者中，产生了强烈的免疫反应，并在12-23个月内显示出无疾病进展。此外，疫苗接种引起了转移性事件累积率的显著降低，并持续了无进展生存期。当这些RNA突变体疫苗与PD-1阻断联合使用时，三分之一的患者对疫苗产生了完全反应。研究表明，疫苗耐受性良好，有7名患者显示出与疫苗相关的免疫反应。除了这次试验外，另一项I期多中心研究测试了mRNA-4157（一种基于专有算法选择的新抗原编码的脂质包裹的个性化疫苗）单药治疗或与pembrolizumab联合用于切除的实体肿瘤（包括黑色素瘤）。147 在包括3名黑色素瘤患者的13名单药治疗组中，12名在平均随访8个月后仍然无病，没有观察到超过2级的与药物相关的不良事件。此外，GenenTech和BioNTech开始了一系列的I/II期试验，用于个性化脂质包裹的mRNA疫苗与atezolizumab或pembrolizumab的组合（例如，NCT03289962和NCT03815058）。所有这些证据表明，与其他抗癌方法结合使用的个性化mRNA疫苗可能为黑色素瘤治疗铺平了道路。

已经开发了多种mRNA疫苗用于黑色素瘤治疗，在临床研究中显示出潜在的治疗效力。然而，还没有mRNA疫苗被正式批准用于黑色素瘤治疗。mRNA疫苗与其他治疗策略的结合可能进一步提高其有效性，并促进其潜在的批准。

4.2.针对脑癌的mRNA疫苗

原发性脑癌在成人中较少见，占全球所有癌症类型的1-2%。恶性神经胶质瘤是脑癌中最常见的亚型，其中胶质母细胞瘤是最具侵略性的亚型。脑癌的5年生存率取决于其恶性程度，恶性神经胶质瘤大约为32%，胶质母细胞瘤在美国大约为5%。脉冲DC肿瘤mRNA疫苗是应用于人类恶性神经胶质瘤的最早的mRNA形式之一。两项研究涉及了自体肿瘤mRNA负载DC的应用。第一项是一项临床研究，招募了5名接受恶性神经胶质瘤部分切除而未接受其他治疗的患者。所有患者在用自体肿瘤mRNA负载DC治疗后显示出特异性CD8+细胞毒性T细胞反应，其中3名对自体神经胶质瘤细胞显示出强大的细胞溶解活性。另一项研究在I/II期研究中招募了7名胶质母细胞瘤患者，评估DC脉冲化癌症干细胞mRNA的效力。在标准化疗结束后的第一周内对所有患者进行了两次疫苗接种，然后每周接种一次，持续3周，接着每周接种一次或每两周使用一次替莫唑胺。尽管在5名患者中观察到肿瘤复发（分别在治疗后10、15、17、22和29个月），但在接种组中第一个经历复发的患者之前，对照组中有6名患者死亡，而7名中的3名存活了1000多天。为了发挥更具体的抗肿瘤效果，一项针对胶质母细胞瘤的随机和盲法临床研究使用了编码CMV pp65的DC脉冲mRNA疫苗，因为这种蛋白在>90%的胶质母细胞瘤中表达，而不在周围正常组织中表达。作者评估了疫苗部位预处理对DC迁移的影响。12名患者被随机分为两组，并接受了百日咳/白喉类毒素或未脉冲的自体DC的单侧疫苗部位预处理。百日咳/白喉和mRNA疫苗的治疗显著延长了总体和无进展生存期，50%的患者存活了36.6个月以上。所有长期存活者在几个月内都检测到了pp65特异性免疫反应，pp65特异性干扰素-γ水平的增加与总体生存相关。随后的DC迁移研究涉及100名切除了IV级胶质母细胞瘤的患者，但结果未提供（NCT02366728）。目前正在进行两项临床试验，研究人类CMV pp65-LAMP在胶质母细胞瘤中的有效性，结果尚未披露（NCT02465268，NCT03688178）。此外，一项pp65-LAMP mRNA负载的1,2-二油酸-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）脂质体疫苗正在I期研究中测试高级别神经胶质瘤和胶质母细胞瘤，结果尚未发布（NCT04573140）。值得注意的是，恶性神经胶质瘤中的mRNA疫苗主要编码TAAs，新抗原基础的mRNA疫苗与免疫检查点抑制剂一起是否能够在神经胶质瘤中显示出更高的效力仍有待研究。

4.3.非小细胞肺癌（NSCLC）的mRNA疫苗

肺癌是全球第二常见的癌症，也是导致癌症死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的85%。5年生存率在可切除疾病中约为60%，在无法切除的局部疾病中约为33%，在有转移的扩展疾病中为6.3%。CV9201和BI1361849（CV9202）是两种在NSCLC中经过临床测试的mRNA疫苗。CV9201由一种精氨酸配方的序列优化mRNA组成，编码五种与NSCLC相关的抗原：MAGE-C1、MAGE-C2、NY-ESO-1、5T4和Survivin。CV9202的组成与CV9201相同，另外还包括了mucin-1。

已经启动了多项临床研究来调查它们在NSCLC中的有效性。2019年，Sebastian等人报告了一项使用CV9201治疗IIIB/IV期NSCLC的I/IIa期研究。共有46名局部晚期（n = 7）或转移性（n = 39）NSCLC患者，在一线治疗后病情稳定，被招募并接受了五次皮内注射CV9201（400–1600 µg mRNA）。在IIa期推荐了最大剂量，所有剂量均良好耐受，大多数不良事件是注射部位的轻度至中度反应和类似流感的症状。在IIa期63%的可评估患者中观察到了抗原特异性免疫反应，60%（18/30）的患者显示出IgD+CD38hi B细胞的两倍以上活化。31%（9/29）和69%（20/29）的患者分别显示出稳定和进展性疾病。中位总生存率和无进展生存率分别为5个月和10.8个月，2年和3年生存率分别为26.7%和20.7%。

同年，Papachristofilou等人报告了一项Ib期试验，评估CV9202与局部放射治疗结合使用在26名患有IV期NSCLC的患者中的有效性，这些患者在标准一线治疗后病情稳定或部分反应。这些患者被分为三个层次：1.非鳞状NSCLC，在接受四个或更多周期的培美曲塞和铂类基础治疗后部分反应/病情稳定，且EGFR无突变（n = 16）；2.鳞状NSCLC，在接受四个或更多周期的非铂化合物和铂类基础治疗后部分反应/病情稳定（n = 8）；3.非鳞状NSCLC，在接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗3-6个月后病情稳定/部分反应，EGFR突变（n = 2）。患者接受了两次CV9202注射，然后进行放射治疗（4 × 5 Gy）。1和3层次的患者随后接受了三次额外的CV9202治疗，而2层次的患者接受了四次，之后所有患者每3周接种一次CV9202，持续前6个月，然后每6周接种一次。在病情进展需要系统二线治疗或患者遇到不可接受的毒性的情况下继续接种CV9202。1和3层次的患者分别接受了维持性培美曲塞或继续EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗。在所有三个层次中（共25名可评估患者）检测到抗原特异性免疫反应，20名患者对CV9202抗原之一或多个的免疫反应幅度比基线至少增加了两倍。10名患者与基线值相比至少增加了两倍功能性CD8+/CD4+ T细胞。12名患者（12/26）表现出稳定疾病，1名患者显示出部分反应，并且也接受了培美曲塞维持治疗。最常见的CV9202相关副作用是类似流感的症状和注射部位反应，有3名患者出现3级（疲劳和发热）。

最近，一项I/II期研究（NCT03164772）完成了对CV9202与免疫检查点抑制剂durvalumab（针对PD-L1）和tremelimumab（针对CTLA-4）结合用于NSCLC治疗的安全性和有效性的评估，但结果尚未发布。此外，已经注册了一项涉及NSCLC和晚期食道癌患者的临床研究（NCT03908671），使用编码肿瘤特异性抗原的个性化mRNA疫苗。尽管一部分NSCLC患者从mRNA疫苗治疗中受益，但总体生存率仍然有限，如已发布的研究报告。需要进一步优化mRNA疫苗并选择适当的联合疗法以提高其有效性。此外，只有少数研究报告了发现，未来在NSCLC中应用mRNA疫苗需要更多的临床试验。

4.4.卵巢癌的mRNA疫苗

卵巢癌是最危险的妇科癌症之一，2020年全球约有314,000个新病例和207,000例死亡。它约占女性癌症相关死亡的5%，已成为全球女性癌症相关死亡的第五大原因。2004年，一种编码叶酸受体-α（FR-α）的DC脉冲mRNA疫苗被用于治疗复发性转移性卵巢癌。这项研究中涉及的是一名62岁的女性，被诊断为晚期浆液性乳头状卵巢癌IIIc，有广泛的腹膜癌和CA-125增加。该患者接受了两次肿瘤减负手术，并经历了两次肿瘤复发。第二次复发时开始使用编码FR-α的mRNA工程化自体DC的疫苗治疗，共接种了10次疫苗，每4周一次。CT显示，在治疗前和最后一次接种后3个月比较，肿瘤体积部分反应。16个月的随访CT显示，淋巴结转移减少了50%以上，并且接种疫苗诱导了FR-α特异性免疫反应。与接种前样本相比，接种6次疫苗后，FR-α刺激的CD8+细胞和FR-α刺激的CD4+细胞产生的IFN-γ分别增加了30倍和15倍。类似地，与接种前样本相比，接种疫苗后颗粒酶B增加。没有观察到与治疗相关的全身或局部副作用，表明疫苗耐受性良好。另一篇报告了在卵巢癌和癌肉瘤中应用编码WT1的DC脉冲mRNA的情况。两名患者，一名患有浆液性卵巢癌，另一名患有卵巢癌肉瘤，接受了四次每周接种疫苗，这在卵巢癌中诱导了增加的CD137+抗原特异性T细胞、IL-2和IFN-γ，在卵巢癌肉瘤中诱导了CD137+抗原特异性T细胞、IL-2和TNF-α。不幸的是，在四次接种疫苗后疾病进展，患有卵巢癌的患者在接受疫苗治疗结束后存活了19个月，而患有卵巢癌肉瘤的患者存活了12个月。同年，进行了一项I期研究，评估了使用完全成熟的TERT-mRNA和survivin-肽双载DCs进行主动免疫疗法的安全性，在15名晚期上皮性卵巢癌患者中进行。然而，尽管研究已经完成，但结果尚未发布（NCT01456065）。目前正在招募卵巢癌患者的首次人体、开放标签I期研究，研究脂质体配方mRNA疫苗与（新）辅助化疗的联合使用（NCT04163094）。遗憾的是，2021年终止了一项利用自体DCs载有扩增的卵巢癌干细胞mRNA、hTERT和survivin的I/II期试验（NCT01334047），没有发布结果。在卵巢癌中使用mRNA疫苗仍处于初期阶段，临床试验中招募的患者数量有限。应进一步探索mRNA疫苗在卵巢癌中的有效性，以便在更多的患者中更好地评估其有效性。

4.5.前列腺癌的mRNA疫苗

前列腺癌是全球男性中第二常见的癌症，也是导致癌症相关死亡的第五大原因，约有1000万男性被诊断。每年在全球范围内造成超过400,000例死亡，预计到2040年，这一数字将达到每年超过800,000例。Islam等人开发了一种含有编码OVA的mRNA和棕榈酸修饰的TLR7/8激动剂R848（C16-R848）的佐剂脉冲mRNA疫苗纳米颗粒，封装在脂质-聚乙二醇壳中。这种疫苗成功地保留了封装的C16-R848的佐剂活性，并显著提高了mRNA转染效率，超过95%。这种高效的转染效率导致了在抗原呈递细胞中MHC I类分子上OVA mRNA衍生抗原的呈递增强。接种疫苗通过改善OVA特异性CD8+ T细胞在表达OVA的同种异体前列腺癌小鼠模型中的扩展和浸润，激发了强大的适应性免疫反应，并在移植后（与对照组相比减少60%）抑制了肿瘤生长。

CV9103编码前列腺癌中的四种TAA：PSA、PSMA、PSCA和STEAP，并且是首个进行人体测试的mRNA疫苗。两项关于CV1903在前列腺癌应用的临床试验已经进行。一项（NCT00831467）研究了三个递增剂量（256毫克、640毫克和1280毫克总mRNA）对三到六名前列腺癌患者的影响，但结果尚未公布。另一项开放性、I/II期、非对照、前瞻性研究（NCT00906243）的第一阶段确认了每抗原320微克RNA的剂量安全性，为第二阶段提供了推荐剂量，以探索该剂量的免疫活性。共招募了44名PSA升高且大多数存在转移（超过80%）的患者，结果显示疫苗在前列腺癌患者中诱导了较高的免疫原性率；大约80%的患者无论HLA背景如何都观察到了抗原特异性T细胞，大约58%的患者对多种抗原有反应。个别患者的PSA水平稳定，有一名患者的PSA下降超过85%。在使用最高剂量后，6名患者观察到一种剂量限制性毒性，即尿潴留。最常见的不良事件是注射部位的反应或类似流感的症状（例如，寒战和发热）。

由于CV9103的有利安全性和强烈的抗原特异性免疫反应，随后进行了临床评估，以评估两种额外的抗原，PAP和黏蛋白-1，开发了一种新疫苗CV9104，并在两项临床研究中使用。第一项试验（NCT01817738）招募了患有去势难治性转移性前列腺癌的患者，他们接受了手术或雄激素抑制治疗（通过GNRH激动剂或拮抗剂）。在第1、2和3周以1920微克的剂量开始疫苗接种，然后在第5、7、9、12、15、18和24周继续接种，之后每6个月接种一次，持续12个月，之后每3个月一次，直到治疗停止。从随机化开始的总生存期可达3.5至4年。使用CV9104的第二项试验（NCT02140138）是一项开放标签随机试验，涉及35名高风险和中风险的前列腺癌患者。患者在第1、2、3和5周接受了四剂CV9104疫苗，然后这些患者在一周内接受了根治性前列腺切除术。主要结果是评估疫苗对抗原特异性细胞和体液免疫反应，次要结果是测量不良事件的发生率和严重程度以及PSA血清水平的变化。然而，到目前为止还没有提供任何临床治疗结果。总的来说，针对前列腺癌的mRNA疫苗大多处于尝试阶段，其在生存方面的潜在价值需要更多的临床结果支持。

4.6.针对血液系统癌症的mRNA疫苗

血液系统恶性肿瘤包括涉及造血干细胞异常增殖的一系列疾病，包括白血病、骨髓瘤和淋巴瘤。根据国际癌症研究机构发布的2020年全球癌症统计数据，白血病是血液疾病中癌症死亡的首要原因，也是全球癌症死亡的第十大原因（www.iarc.fr）。常见的白血病类型包括急性髓系白血病（AML）、慢性髓系白血病、慢性髓单核细胞白血病、慢性中性粒细胞白血病和非典型慢性髓系白血病。迄今为止，mRNA疫苗主要应用于血液系统癌症中的AML。2005年，Jarnjak-Jankovic表明，树突状细胞脉冲肿瘤mRNA疫苗在体外触发了针对白血病细胞的特异性T细胞反应。随后，Driessche等人报告了一项自体树突状细胞脉冲mRNA疫苗的I期临床研究，该疫苗编码WT1，用于10名AML患者。患者每两周接受一次皮内注射，接受5、10或20 × 10^6个树突状细胞在大腿内侧或上臂的内侧区域。所有患者在整个试验期间都很好地耐受了四种剂量，没有观察到自身免疫或急性毒性。该团队进一步展示了上述疫苗在AML患者的I/II期研究中的使用结果。接受多药化疗后血液学缓解的患者在多药化疗后1个月接受了四次双周疫苗接种。五名（50%）患者（其中两名对化疗有抵抗性）在接受皮内疫苗接种后显示出完全疾病缓解（血液中无母细胞，骨髓中母细胞少于5%），并且髓母细胞百分比降至正常水平。在五个人中，有三个人表现出长期反应，完全缓解持续了三年多。长期反应与WT1特异性CD8+ T细胞数量之间发现了显著的正相关性。这项研究在两年后在更多的患者中重复进行，总共17名，其中八人显示出完全反应，中位无复发生存期为47个月。在此基础上，该小组报告了一项关于DC脉冲mRNA疫苗编码WT1作为高风险复发AML患者的缓解后治疗的II期试验。30名患者中有13名显示出抗白血病反应，五年总生存率和无复发生存率分别为53.8%和50%（非反应者分别为7.7%和30.8%）。年龄≤65岁且完全缓解的患者显示出比年龄>65岁的患者更长的5年生存期（分别为69.2%和30.8%），这比瑞典急性白血病登记处的年龄≤65岁和>65岁的患者中的51.7%和18%还要多。同年，Khoury等人还研究了21名成人AML患者中的DC脉冲mRNA疫苗编码hTERT：16名在第一次完全缓解，3名在第二次完全缓解，2名早期疾病复发。在完全缓解的患者中，11名（58%）发展出特异性T细胞反应，并在52个月的中位随访中无疾病。60岁以上的四名（57%）患者在54个月的中位随访中无疾病复发。为了提高针对单一抗原的mRNA疫苗的有效性，Lichtenegger等人进行了首次人体I期试验，涉及10名AML患者，使用TLR7/8成熟的DC脉冲mRNA疫苗编码WT1和PRAME（两种与AML相关的抗原）以及CMV pp65。七名患者接受了完整的常规10次疫苗接种，导致外周血液中WT1（2/10）、PRAME（4/10）和CMV pp65（9/10）特异性CD8+ T细胞增加，以及CMV pp65诱导的CD4+ T细胞（4/7）。中位无复发生存期为1084天，而中位总生存期在1057天后仍未达到，观察结束时有五名患者（50%）无复发。

一些研究集中在慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤上。这些研究大多在临床前试验中进行。Kokhaei等人表明，与未脉冲的树突状细胞相比，DC脉冲mRNA疫苗并未显著增强产生IFN-γ的T细胞在对抗B细胞慢性淋巴细胞白血病方面。相反，mRNA疫苗在淋巴瘤中显示出有效性。2011年，Fotin-Mleczek等人报告了一种两组分mRNA疫苗（与精蛋白复合）的使用，该疫苗编码TLR7和肿瘤抗原Gallus gallus OVA、HsPSMA或HsSTEAP，用于治疗基于E. G7-OVA的T细胞淋巴瘤的小鼠模型，其中E. G7-OVA是一种稳定表达Gallus gallus OVA的小鼠T细胞淋巴瘤细胞系。疫苗触发了抗原特异性的CD4+和CD8+ T细胞反应，并维持了免疫记忆，疫苗接种在预防和治疗背景下都介导了强烈的抗肿瘤反应。2021年，Tusup等人对使用mRNA疫苗诱导免疫反应针对TCR CDR3区域的效力进行了评估，使用基于EL4 T淋巴瘤细胞系的小鼠模型，结果表明这是一种可行的保护方法，以防止T淋巴瘤。2022年，Slam等人开发了一种mRNA疫苗，由编码OVA的mRNA和棕榈酸修饰的TLR7/8激动剂R848（C16-R848）以及脂质-聚乙二醇壳组成。疫苗显著增加了OVA特异性CD8+ T细胞在表达OVA的同种异体移植小鼠模型中的扩增和渗透，并在肿瘤植入前给予疫苗时防止了肿瘤生长（与对照组相比减少了84%）。目前，正在进行一项I期研究，评估mRNA-2752（一种脂质纳米颗粒包裹的mRNA，编码人类OX40L、IL-23和IL-36γ）单独使用和与免疫检查点阻断联合使用在实体瘤和淋巴瘤中的肿瘤内注射后的效应（NCT03739931）。

总的来说，mRNA疫苗在临床试验中对AML显示出有希望的效果，尽管还没有被批准为标准治疗。除了AML，其他人类血液系统癌症中的mRNA疫苗主要处于临床前阶段，需要更多的临床试验来研究它们的有效性。

4.7.针对消化系统癌症的mRNA疫苗

癌症可能发生在胃肠道的任何组织中，包括结肠、胃、食管、肝脏和胰腺。消化系统癌症是全球癌症发病率和死亡率的主要原因，每年有300万新病例和200万胃肠癌死亡病例。Gholamin等人在体外使用DC脉冲肿瘤mRNA疫苗治疗食管鳞状细胞癌，结果显示显著诱导细胞毒性（中位数>18.7%，与对照组相比）和INF-γ分泌（比对照组多两倍）。Mahdi Forghanifard等人还使用编码MAGE-A4、NY-ESO1和LAGE1的DC脉冲mRNA疫苗，在体外促进了CTL对食管细胞的激活。Peng等人使用来自HepG-2细胞或肝细胞癌（HCC）患者的样本的DC脉冲mRNA疫苗，结果显示在体外HCC中CD8+ T细胞数量增加，促进了CTL的细胞毒性活性。使用mRNA 5671的临床前研究评估了其在结直肠癌中的治疗效果。该疫苗编码四种常见的KRAS突变（G12C、G12D、G12V和G13D）。当单独使用或与pembrolizumab联合使用时，它促进了小鼠中CD8+ T细胞反应的增加。同样，Kim等人表明，使用修饰的钙网蛋白和TAT蛋白转导域的DC脉冲CEA mRNA疫苗在结肠癌小鼠中诱导了强大的CD4+和CD8+ T细胞反应和抗肿瘤效应。在临床上，Wan等人使用编码甲胎蛋白的CD40-B细胞脉冲mRNA疫苗治疗HCC，因为他们的假设是疫苗可能会增强强大和原始的T细胞反应；然而，他们至今没有报告任何临床前或临床结果。Maeda报告了一项关于使用DC脉冲热休克蛋白70编码mRNA疫苗在与丙型肝炎病毒相关的HCC中的I期临床试验。共有12名患者入组，分为三个队列，每三周接受三次疫苗接种（1 × 10^7、2 × 10^7和3 × 10^7 DCs）。根据预处理结果，3 × 10^7 DCs的剂量是推荐剂量。两名患者经历了完全反应且没有复发，五名患者经历了疾病进展，五名患者经历了疾病稳定。两名完全反应的患者分别在44个月和33个月内没有疾病复发。Lesterhuis等人比较了在诊断为可切除结直肠癌肝转移的患者中DC脉冲CEA肽和DC脉冲CEA mRNA疫苗的效果。所有患者每周接受三次静脉和皮内疫苗接种。然而，在肽组的8名（11名中的8名）患者中检测到抗CEA特异性抗体，而在mRNA组的5名患者中没有发现抗体。此外，编码新抗原的mRNA疫苗在胃肠道癌症患者中诱导了特定的T细胞免疫反应。mRNA基础疫苗mRNA 4650在治疗各种消化系统癌症，包括胃肠癌和肝癌中进行了临床评估。用肌肉内注射mRNA 4650治疗的胃肠癌患者发展了针对肿瘤新抗原的CD4+和CD8+ T细胞反应。mRNA 4157旨在编码34种独特的新抗原，正在进行一项I期临床研究，研究对象为MSI-high结直肠癌和其他实体瘤患者。它诱导抗原特异性T细胞，单独使用或与pembrolizumab联合使用时耐受性良好，导致完全或部分反应。Suso等人发表了一篇胰腺癌患者使用DC脉冲端粒酶编码mRNA疫苗治疗的病例报告。患者是一名62岁女性，在手术后发展出多发性转移性淋巴结病变后，接受了标准吉西他滨化疗。由于出现严重的中性粒细胞减少症，化疗停止，并被疫苗替代。在32个月的疫苗接种后，患者的淋巴结转移显著减少，与其他淋巴结相比，病变的代谢活动没有任何增加。此外，在3年的疫苗接种期间没有观察到任何严重的治疗相关不良事件。2013年，Chen等人比较了在体外胰腺癌中DC脉冲mRNA编码黏蛋白-4和/或存活素的效力。所有三个队列都诱导了CTL反应，对于共转染两种抗原的DC来说更强。已完成一项I期临床试验，并评估了包括结直肠癌在内的多种癌症的效力、安全性和耐受性，尽管结果尚未公布（NCT03948763）。2020年，一项I/II期试验评估了基于mRNA的、针对自体胃肠癌中的新抗原的个性化疫苗的安全性和免疫原性（NCT03480152）。在肿瘤浸润性淋巴细胞中鉴定了mRNA疫苗的特定免疫原性突变作为靶点。疫苗引发了针对预测的新表位的突变特异性T细胞反应，但在这四名接受治疗的患者中没有发现客观的临床反应。如在NSCLC的mRNA疫苗段落中提到的，一项针对NSCLC患者和晚期食管癌患者的个性化mRNA疫苗的临床研究已经注册（NCT03908671），食管癌的结果仍然未知。

总的来说，尽管使用mRNA疫苗对抗消化系统癌症的临床试验有限，但在部分患者中显示出了一定的效果，为进一步开发治疗消化系统癌症的有效方法提供了基础。

4.8.针对乳腺癌的mRNA疫苗

乳腺癌是女性中诊断最频繁的癌症，并且是全球癌症相关死亡的主要原因。2020年全球癌症统计报告显示，女性乳腺癌已经超过肺癌，成为诊断最频繁的癌症。乳腺癌包括三个主要亚型：ER+、HER2+和三阴性乳腺癌（TNBC）。传统的内分泌或靶向药物对TNBC的效果不如其他亚型，TNBC的预后最差，超过50%的患者在诊断后的最初3到5年内经历复发，中位总生存期为10.2个月。2013年，由BioNTech AG领导的学术界和工业界的五个合作伙伴启动了Mutanome Engineered RNA Immuno-Therapy项目（NCT02316457），从临床和工业角度验证针对TNBC患者个体表达的肿瘤抗原和肿瘤新抗原的开创性mRNA疫苗概念。该项目开发了一个计算医学平台，用于识别TNBC患者的肿瘤新抗原和TAAs，建立了一个mRNA疫苗仓库，用于共享肿瘤抗原，解决了超过95%的TNBC患者，以及生产个性化mRNA疫苗的制造过程。此外，该平台评估了与疫苗接种后临床事件相关的分子和免疫学标志物的生物标志物，并确定了协同剂和优化的个性化疫苗方案。疫苗由“现成的”mRNA组成，这些mRNA从预合成的mRNA中选择，并编码个体患者肿瘤中表达的新抗原，以及按需工程化的mRNA，编码包含非同义突变的患者特定序列片段。在治疗前对每个肿瘤进行分析，以选择适当的共享肿瘤抗原，并通过外显子测序检测突变。使用尖端平台根据分析结果的设计、制造和发布定制的mRNA疫苗。2019年，Schmidt报告了在德国和瑞典进行的I/II期试验，评估了这种个性化mRNA疫苗的可行性、安全性和生物学效果。患者在标准治疗结束后被分配到两个研究组之一。1组的患者接受了编码根据肿瘤抗原表达谱选择的共享TAAs的疫苗的八个疫苗接种周期（mRNA WAREHOUSE疫苗）。2组的患者接受了mRNA WAREHOUSE疫苗的治疗，随后接受了编码通过下一代测序鉴定的个性化20个独特新表位的疫苗的八个疫苗接种周期（mRNA MUTATION疫苗）。在欧洲医学肿瘤学会年会上披露了2组患者的初步免疫反应结果。所有14名接种mRNA MUTATION疫苗的患者中发现了针对1-10个新表位的疫苗触发的CD4+和/或CD8+ T细胞反应，以及大量新表位特异性T细胞反应（外周CD8+ T细胞的10.3%）。此外，大约30%的外周CD8+ T细胞表现出多样化的CD8+ T细胞反应，其特征是大量的多表位TCR克隆型，这种反应在最后一次疫苗接种后至少6个月保持高水平。尽管疫苗接种诱导了特定的T细胞反应，但生存数据仍未公布，mRNA疫苗的效力尚不清楚。此外，只有一项研究调查了个性化抗乳腺癌mRNA疫苗的效力，需要更多的试验来促进它们在临床实践中的应用。

5.mRNA疫苗在免疫性疾病中的应用

自身免疫性疾病的特征是慢性炎症，这是由于对自身抗原的免疫反应失调造成的。许多使用mRNA疫苗针对癌症或传染病的临床研究已经展示了它们触发自身免疫疾病的潜力。然而，小鼠模型揭示了它们治疗自身免疫疾病的能力，尽管还没有进行临床应用。生理性的外周耐受的诱导和维持主要由抗原呈递细胞（APCs）呈递自身抗原来决定，这些细胞的共刺激分子表面表达减少，如DC86。传统的U型mRNA疫苗通常会引发由TLR信号驱动的强烈的I型T辅助细胞反应。Krienke等人介绍了一种脂质体配方，该配方将mRNA疫苗编码的抗原系统地传递到淋巴结组织驻留的CD11c+ APCs，并用N1-甲基伪尿嘧啶替换尿嘧啶（U）。这种方法避免了在小鼠中显著激活CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、CD11+ APCs、自然杀伤细胞和B细胞，以及IFN-α或其他炎症细胞因子的分泌，表明纳米粒子配方的N1-甲基伪尿啶修饰的mRNA适用于脾脏CD11c+ APCs的非炎症性蛋白传递。在由MOG（髓鞘少突胶质细胞糖蛋白在DCs中的表位）的选择性表达诱导的多发性硬化症的小鼠模型中，小鼠在用MOG免疫后接种了编码N1-甲基伪尿嘧啶mRNA的疫苗，结果表明它们免受疾病发展的影响。疫苗接种还防止了已经患有疾病的小鼠的疾病进一步发展，甚至在某些情况下逆转了病理。治疗通过诱导FOXP3+调节性T细胞和增加T细胞耗竭标志物的表达（例如，PD-1、CTLA4、TIGIT、TIM-3和LGA-3），抑制了疾病促进的TH1、TH17和TH1/TH17细胞。疫苗接种没有影响对无关抗原的免疫反应，这种方法在由不同抗原（PLP、MBP和MOBP）诱导的模型中也是有效的，表明这种方法的重要方面，例如优化mRNA疫苗以引发针对特定病理的保护性免疫反应，并维持治疗自身免疫疾病的抗原特异性免疫耐受。

过敏是对通常对大多数人无害的外来物质的免疫系统的超敏反应。这种外来物质被称为过敏原，会触发免疫反应，导致各种症状，如瘙痒、打喷嚏、眼睛流泪和皮疹。常见的过敏原包括花粉、尘螨、某些食物、药物和昆虫毒液。过敏可以从轻微到严重，有时甚至是危及生命的。mRNA疫苗还提供了一种更安全的方法来预防过敏状况，通过编码过敏原并提供比传统过敏原提取物更纯净的免疫原。在小鼠中，编码过敏原的mRNA疫苗被发现通过激活Th1细胞反应有效预防I型过敏。免疫后，小鼠暴露于相应的过敏原，结果炎症特征（例如，嗜酸性粒细胞、IL-4和IL-5）减少，而抗炎反应增强（例如，产生IFN-γ的细胞的诱导）。更重要的是，mRNA疫苗已被证明能在小鼠中产生长期记忆反应，导致在再次暴露于过敏原时产生强大的抗炎反应。这些发现说明了mRNA疫苗针对过敏的潜力，无需进行加强疫苗接种。

6.mRNA疫苗在组织损伤中的应用

组织损伤指的是身体组织发生的任何物理性伤害或损害。这可能是由多种因素造成的，比如外伤、感染、炎症以及暴露于有害物质或辐射。组织损伤可以影响身体的任何部位，包括皮肤、肌肉、骨骼、器官和神经。心血管损伤是全球对人类健康构成的主要威胁。它们包括但不限于冠状动脉心脏病、高血压、心力衰竭、血管钙化和心脏纤维化。心血管损伤大多数情况下是不可逆的，只能控制。2016年，阿斯利康开发了AZD8601，一种编码VEGF-A165的mRNA疫苗，其引发先天免疫反应的程度最小。在临床前模型中使用AZD8601能够在局部组织诱导更多的血管生成，并以剂量依赖性方式显著加速慢性伤口的愈合。2017年，随后在进行冠状动脉旁路移植手术的冠状动脉疾病患者中开始了临床试验（NCT03370887）。患者被随机且平均分为三组，并进一步用不同剂量的AZD8601或安慰剂治疗，主要终点是评估AZD8601的安全性。结果在2021年美国心脏协会科学会议上报告，显示了AZD8601的安全性和耐受性以及探索性疗效目标的积极趋势。Rurik等人开发了一种基于嵌合抗原受体T细胞的抗纤维化治疗策略，使用CD5靶向LNPs-mRNA。将编码FAP嵌合抗原受体的CD5/LNP-mRNA的10微克静脉注射到由AngII/PE诱导的心脏损伤小鼠中。超声心动图显示，在最初治疗后2周，受损小鼠的功能有了显著改善。值得注意的是，左心室舒张功能显著改善，并在随访期间恢复到原始健康水平。与用生理盐水治疗的小鼠相比，用LNP-mRNA治疗的小鼠在细胞外基质负担方面的改善更为明显。总的来说，这些发现令人鼓舞，为治疗不可逆的心血管疾病提供了可能性。

除了心血管疾病，mRNA疫苗在多种软组织损伤中也显示出有效性。研究发现，含有编码HGF和EGF的修饰核苷mRNA的mRNA-LNPs能够刺激患有慢性胆碱缺乏乙氨酸介导的肝损伤和急性对乙酰氨基酚诱导的肝毒性的小鼠的肝脏再生。同年，另一项研究使用编码VEGF-C的mRNA诱导小鼠淋巴管生长。通过给予低剂量的VEGF-C mRNA负载的脂质纳米颗粒（mRNA-LNPs），诱导了针对性的淋巴管生长，导致实验小鼠模型中淋巴水肿的显著逆转和淋巴功能的恢复。在糖尿病小鼠模型中，通过矿物涂层微粒传递修饰核苷的mRNA编码FGF-2，通过加速完全伤口闭合的过程，改善了皮肤伤口的愈合。

2015年，Elangovan等人展示了基于mRNA的治疗策略在骨再生领域的有希望的潜力。他们采用了伪尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶修饰的mRNA编码BMP-2，与聚乙烯亚胺（PEI）结合，并在植入大鼠颅骨缺损前嵌入到胶原支架中。经过4周的持续时间，PEI-BMP-2 mRNA激活的基质与PEI-BMP-2 pDNA激活的基质相比，在骨再生方面显示出显著的改善。微型计算机断层扫描分析显示，用PEI-mRNA和PEI-pDNA复合物嵌入的支架治疗的缺陷中，骨量和再生骨的总体积都有显著增加。特别是，用PEI-mRNA治疗的缺陷骨量高出3.9倍，而再生骨的总体积比阴性对照组高出1.9倍。Balmayor等人也在大鼠股骨骨缺损模型中证实了修饰核苷BMP-2 mRNA治疗的成骨潜力。此外，在纤维蛋白凝胶基质中给予低剂量（2.5 µg/缺陷）的修饰核苷mRNA，与纤维蛋白对照组相比，显示出加速的骨愈合，仅在应用后2周就观察到了显著的改善。为了增强长期mRNA传递到特定细胞并创造一种方便的即用产品，研究人员开发了一种称为转录激活基质（TAMs）的真空干燥构建物。在非关键性股骨骨缺损大鼠模型中，胶原海绵预加载了修饰核苷BMP-2 mRNA负载的脂质纳米颗粒（mRNA-LNPs），与空胶原海绵相比，显著增强了骨生成。在室温下表现出至少6个月的卓越稳定性，并促进了长达6天的蛋白质生成。这项开创性研究表明，编码BMP-2的TAMs在将持久mRNA传递到目标细胞方面是有效的。在随后的研究中，研究人员探索了修饰核苷BMP-2编码TAMs在促进大鼠股骨缺损模型中新骨形成方面的剂量依赖性影响。微型CT和组织学分析揭示了更高剂量的产品（15 µg/缺陷）与较低剂量（3.75 µg/缺陷）相比，新形成的骨量大约是后者的两倍。一项研究比较了BMP-9-PEI激活基质（胶原支架）和BMP-2-PEI激活基质在促进骨再生方面的能力。结果揭示了BMP-9 mRNA转染在增强体外人骨髓间充质干细胞成骨分化方面比BMP-2 mRNA给药具有更优越的能力。此外，当植入大鼠颅骨缺损时，BMP-9 mRNA在再生骨的连通密度方面显示出与BMP-2 mRNA相比显著的2倍增加。为了增强基因激活的胶原膜，通过将穿孔的胶原膜浸泡在含有BMP-9 mRNA-PEI复合物的溶液中，然后进行冷冻干燥过程，进行了额外的改进。将这种产品应用于大鼠颅骨缺损后，在4周治疗期间观察到了显著且重要的新骨形成。最近，研究人员调查了mRNA、干细胞移植和支架结合疗法在骨再生方面的应用。在大鼠颅骨缺损模型中，将修饰核苷BMP-2和VEGF-A mRNA转染的骨髓间充质干细胞植入胶原支架中，显著增强了骨再生。BMP-2和VEGF-A mRNA的同时传递显示出协同效应，有效地促进了成骨和血管生成过程。这种协同作用在与单独使用BMP-2或VEGF-A治疗相比时，产生了更优越的愈合效果。这些发现强烈表明，使用多种编码生长因子的mRNAs的组合，以及细胞疗法和生物材料支架，是一种可行的策略，可以获得骨再生的有利结果。

总的来说，mRNA疫苗在促进组织生成方面显示出有希望的潜力。除了上述损伤外，mRNA疫苗可能能够促进其他组织的生成。

7.mRNA疫苗在罕见病领域的应用

罕见病被定义为影响一小部分人口的医疗状况，其特点是患病率低，并且由于其罕见性，通常对其了解有限。患者可能很难找到适当的医疗护理和治疗。据报道，mRNA疫苗有潜力治疗多种罕见病。

囊性纤维化是一种遗传性疾病，主要影响肺部、胰腺和其他器官。它是由CFTR基因的突变引起的，导致肺部和其他器官中产生粘稠的粘液。这种粘液可以堵塞气道，使人呼吸困难，导致慢性肺部感染、肺损伤和呼吸衰竭。囊性纤维化还会影响胰腺，引起消化问题和营养不良，还可能导致其他并发症，如肝病、糖尿病和不孕。囊性纤维化是一种终身疾病，目前没有治愈方法，治疗有助于症状管理和提高生活质量。2018年，Robinson等人报告说，一种临床相关的脂质纳米颗粒包装的化学修饰mRNA编码CFTR，在患者来源的支气管上皮细胞中增加了膜定位CFTR并恢复了其作为氯离子通道的作用；其鼻应用恢复了CFTR介导的氯离子分泌到CFTR缺陷小鼠的传导气道上皮，代表了纠正囊性纤维化的一个有希望的平台。228 MRT5005（编码CFTR蛋白的mRNA）通过雾化给药的临床前评估验证了在小鼠和非人灵长类动物中纠正囊性纤维化。目前正在进行一项I/II期临床研究，寻求参与者参加一项随机、双盲、安慰剂对照研究。该试验旨在评估通过雾化给药给成人囊性纤维化患者MRT5005的安全性、耐受性和生物活性（NCT03375047）。

遗传性代谢紊乱是儿童疾病和死亡的重要原因。这些疾病影响大约1/800的活产儿，通常源于以常染色体隐性遗传模式遗传的单个基因突变。遗传性代谢疾病占儿童急性肝功能衰竭病例的10-15%，死亡率从22-65%不等。mRNA疫苗已在几种罕见遗传疾病中进行了测试，如遗传性酪氨酸血症1型、苯丙酮尿症（PKU）、甲基丙二酸血症（MMA）、丙酸血症（PA）、糖原贮积病1a型（GSD1a）和鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）缺乏症。PKU是一种遗传性代谢紊乱，由于苯丙氨酸羟化酶（PAH）活性不足而引起，导致受影响者的血液和器官中苯丙氨酸（Phe）的积累。如果不治疗，患者会遭受重大的神经系统损伤。通过反复静脉注射装载在LNPs中的小鼠Pah mRNA到PKU（Pahenu2）小鼠模型中，产生了治疗性的PAH蛋白，降低了肝脏、血清和大脑中的Phe水平，并逆转了疾病的进展。这些发现表明，用LNPs配制的Pah mRNA为PKU患者提供了一种替代治疗选择，消除了终身限制Phe饮食的需要。与这种可能性一致，ModernaTx公司（美国马萨诸塞州剑桥市）已将其产品开发管道中包括PAH PKU mRNA-3283（www.modernatx.com/research/product-pipeline）。MMA是一种有机酸血症，具有很高的发病率和死亡率风险，目前没有批准的治疗方法针对其根本原因。这种常染色体隐性遗传疾病阻碍了来自某些蛋白质和脂肪的丙酸盐的代谢。结果是，身体液体和组织中显著积累了甲基丙二酸。这种疾病的主要原因通常归因于线粒体酶甲基丙二酰辅酶A（CoA）变位酶（MUT）的缺乏。反复静脉注射LNP封装的MUT mRNA到低形态Mut−/−，TgINS-CBA-G715V小鼠中，导致血浆MMA浓度降低以及生存率提高。显著的是，全面安全性研究没有发现肝功能测试、炎症细胞因子产生或抗-MMA抗体产生方面的明显变化。目前正在进行一项I/II期临床试验，以评估向孤立性甲基丙二酸血症患者施用LNP封装的人类MUT mRNA（mRNA-3705）的安全性、药代动力学和药效学（NCT04899310和NCT05295433）。PA是一种儿科疾病，由丙酰辅酶A羧化酶（PCC）的线粒体缺乏引起，PCC是一种由PCCA和PCCB基因编码的异源十二聚体酶，它在体内催化丙酰辅酶A羧化为甲基丙二酰辅酶A的过程中发挥重要作用。这种缺乏阻碍了丙酸盐的代谢，导致体内有毒代谢物的积累，如2-甲基柠檬酸盐、3-羟基丙酸盐和丙酰肉碱。静脉注射LNP封装的PCCA和PCCB mRNAs导致在小鼠的低形态疾病模型（Pcca−/−[p. A138T]）的肝脏中生成了治疗水平的PCCA和PCCB。在6个月的持续时间内，反复给药PCCA和PCCB mRNAs封装在LNPs中被良好地耐受。这种治疗方法导致血浆中有毒代谢物水平降低，尽管没有完全正常化。肝脏转氨酶水平保持在正常范围内，没有观察到不良反应。这些发现支持目前正在进行的mRNA-3927（LNP封装的PCCA和PCCB mRNAs）的I/II期研究，以评估该疗法在1岁或以上PA患者的安全性和药效活性（NCT05130437和NCT04159103）。GSD1a是一种遗传性代谢紊乱，由编码葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）催化亚基的基因的常染色体隐性突变引起。这种酶水解葡萄糖-6-磷酸，产生游离葡萄糖。作为糖异生的中心枢纽，肝脏是受这一过程中断影响的主要器官。GSD1a的特点是低血糖、高甘油三酯血症、贫血、肾脏疾病以及增加的终身肝细胞癌风险等症状。最近的一项研究表明，通过反复静脉注射LNP封装的hG6PC-a mRNA在肝脏特异性G6pc敲除小鼠（L. G6pc−/−）中，显著提高了禁食血糖，并降低了GSD1a生物标志物的水平，如糖原、G6P和甘油三酯。治疗和对照动物的血清中细胞因子水平相似，包括IFN-γ、IL-1β、TNFα和IL-6。治疗没有诱导抗G6Pase反应、肝损伤、体重变化或任何痛苦迹象。这些结果支持进一步调查LNP封装的mRNA作为遗传性代谢紊乱的潜在治疗。目前，正在进行一项临床研究，以评估单次静脉注射LNP封装的hG6PC-a mRNA（mRNA-3745）在GSD1a患者中的安全性、耐受性、药代动力学和药效学（NCT05095727）。OTC是尿素循环中的一种关键酶，存在于肝脏中，促进氨甲酰磷酸和鸟氨酸转化为瓜氨酸和磷酸。这个过程在从体内排除氨方面发挥着重要作用。高水平的氨会导致不同程度的神经精神症状。尽管有各种可用的治疗方法，如限制蛋白质饮食和氨清除剂，但重要的是要注意，目前没有明确的治疗方法来解决OTC缺乏的根本原因。Prieve等人证明，NP封装的hOTC mRNA（ARCT-810）成功治疗了OTC缺乏的高氨血症小鼠模型（Otcspf-ash），导致血浆氨和尿嘧啶酸水平正常化，生存率提高，以及良好的安全性。已完成一项I期研究，评估健康成年受试者中ARCT-810的安全性、耐受性和药代动力学，但结果尚未报告（NCT04416126）。目前正在进行两项Ib期临床试验（NCT05526066和NCT04442347），以评估单剂量ARCT-810在临床上稳定的OTC缺乏患者中的安全性、耐受性和药代动力学。

总之，目前尚缺乏能够治愈这些罕见病的治疗方法。mRNA疫苗为长期控制这些疾病提供了可能性，尽管仍处于尝试阶段。需要更多的研究来验证它们针对罕见病的有效性。

8.结论与展望

mRNA疫苗已成为疾病预防和治疗的热点，在临床前和临床试验中占据主导地位，特别是在传染病和癌症领域。然而，除了抗COVID-19 mRNA疫苗外，目前很少有被批准用于疾病治疗的。一些挑战尚未完全解决，可能限制了mRNA疫苗的应用。在实现最佳抗原产生和确保足够佐剂效应之间找到平衡是一个重大挑战。mRNA疫苗的佐剂效应促进了先天和适应性免疫，但过度的先天免疫抑制了mRNA的翻译。5'加帽、核苷修饰、聚(A)尾修饰和HPLC纯化是已经使用的策略，用于减少先天免疫。mRNA和先天免疫系统的载体相互作用需要进一步研究，以实现有效平衡。另一个挑战是mRNA的大规模生产。由于缺乏连续的制造过程，合成、纯化和配方必须在美国三个州的不同设施中进行，大大限制了mRNA疫苗的快速生产。例如，生产数百万剂BNT162b2需要60天，远远不能满足全球60亿人的接种需求（来源于 https://www.nytimes.com/interactive/2021/health/pfizer-coronavirus-vaccine.html）。连续制造过程可能通过将三个设施整合到一个流体系统中来提高mRNA疫苗生产的效率。连续制造可以确保原材料（例如，酶或NTPs）的回收和再利用，避免运输可以显著降低时间和成本。适当的温度控制对于维持疫苗的有效性至关重要。大多数疫苗可以在2-8°C下长期储存，而像BNT162b2和mRNA-1273这样的mRNA疫苗必须分别保存在-80°C和-20°C。这为它们的分发带来了巨大挑战。LNP-mRNA系统的不稳定性是mRNA疫苗储存需要严格温度要求的原因。尽管已经在mRNA-鱼精蛋白配方中加入了各种保护剂（例如，乳酸盐、甘露糖和海藻糖），使其能够在冷冻干燥后在室温下长期储存，正如几项专利中所声称的，但重要的是要注意，当20%（体积重量比）的蔗糖或海藻糖添加到LNPs中并进行冷冻干燥时，保持mRNA传递效率的有效性是有限的。由于冷冻干燥和重组，LNP-mRNA系统的纳米结构变化可能影响LNPs与血浆的相互作用，从而导致体内mRNA传递效率下降。迄今为止，尚无已知解决方案可以满足LNP-mRNA疫苗对极冷储存和运输条件的要求，这可能对未来mRNA疫苗的广泛使用施加重大限制。安全性是使用mRNA疫苗的另一个问题。COVID-19 mRNA疫苗的广泛部署为彻底研究与mRNA疫苗相关的不良反应提供了机会。根据疾病控制和预防中心（CDC，https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/vaccines/safety/adverse-events.html）的安全监测，一些人在接种COVID-19 mRNA疫苗后报告没有副作用，而许多人经历了轻度至中度的副作用，如头痛、疲劳和注射部位疼痛，这些通常是暂时的，通常在几天内解决。尽管接种疫苗后一些反应很少见，但有多起病例报告。过敏反应，一种严重的过敏反应，在接种疫苗的百万剂中大约发生了5例。血栓形成伴血小板减少综合征是一种罕见但严重的不良事件，其特征是在主要血管中形成血栓和血小板计数下降。在接种的百万剂中报告了大约4例，表明其发生率较低但严重性较大。更重要的是，接种mRNA疫苗后心肌炎和心包炎的病例在增加。在研究期间，接种了超过3.5亿剂mRNA疫苗，CDC科学家观察到，接种第二剂mRNA疫苗后，心肌炎的发病率在以下年龄组的男性中最高：12-15岁（辉瑞-生物技术公司的每百万剂70.7例），16-17岁（辉瑞-生物技术公司的每百万剂105.9例），18-24岁（辉瑞-生物技术公司和Moderna的每百万剂分别为52.4例和56.3例）。截至2023年3月2日，已有715份报告经核实符合CDC的心肌炎工作案例定义，结果如下：5-11岁（接种23,376,785剂后23例心肌炎报告），12-15岁（接种25,913,772剂后376例心肌炎报告），16-17岁（接种14,180,263剂后316例心肌炎报告）。导致这些罕见不良事件的机制尚待解决。最后，针对COVID-19的mRNA疫苗的持久性，如辉瑞-生物技术公司和Moderna疫苗，可能会随时间降低。病毒不断演变，可能会出现新的变种，这些变种可能不像原始病毒那样被免疫系统很好地识别，导致疫苗的有效性随时间降低，特别是如果变种变得更加普遍。此外，由于免疫系统对病毒的记忆逐渐消退，疫苗产生的免疫反应也可能随时间减少。这是任何疫苗都会发生的正常过程，但mRNA疫苗的作用机制独特，其下降速度可能更快。此外，疫苗可能无法为某些人群提供强大或持久的保护，如免疫受损的个体或老年人。包括在特定时间间隔内接种mRNA疫苗的加强针、使用不同类型的疫苗（如mRNA和传统疫苗的组合）以及优化mRNA疫苗的储存和运输条件，可以提高疫苗的整体有效性并延长其持续时间。总之，mRNA疫苗的制备和应用技术并不完美，仍需进一步完善。

除了mRNA疫苗普遍存在的问题外，不同疾病还面临特定的挑战。考虑到mRNA疫苗在免疫性疾病、罕见病和组织损伤中的应用仍处于初期阶段，目前尚缺乏评估其在这些疾病背景下的疗效和挑战的研究。因此，选择mRNA疫苗使用更为广泛的传染病和癌症作为讨论mRNA疫苗在特定疾病中障碍的例子。感染性病毒主要分为两类：新出现或重新出现的病毒，以及引起慢性感染的病毒。mRNA疫苗对迅速出现的冠状病毒的保护效果非常出色，其生产成本低、制造容易，表明它们在未来由迅速出现的病毒引起的大流行控制中可能发挥重要作用。然而，这些新出现或重新出现的病毒倾向于快速变异，为开发广泛或季节性的mRNA疫苗带来了挑战。此外，针对能够巧妙逃避先天免疫的慢性感染性病毒产生有效的中和抗体通常很困难。

与传染病不同，癌症是由遗传和表观遗传因素引起的，其特征是复杂和异质的抗原表达，因此需要使用个性化的mRNA疫苗。然而，有几个挑战限制了个性化癌症mRNA疫苗的临床应用，例如，仍然存在的技术障碍限制了对免疫原性肿瘤新抗原的精确检测和定量，以及对肿瘤免疫逃逸的准确生物学机制了解不足。传统的外显子测序没有捕获来自基因组“暗物质”的非典型肽，这可能包括肿瘤表达的大多数新表位。实验和计算方法在识别新抗原方面主要偏向于MHC I表位，对MHC II和罕见等位基因不敏感，导致可靶向免疫原性新抗原的频率显著低估。此外，治疗性疫苗通常在辅助疗法的背景下或在最小残留疾病的情况下效果更好，此时肿瘤负担低，免疫抑制微环境尚未牢固建立。相反，在大负荷肿瘤的肿瘤免疫微环境（TIME）中，由个性化疫苗触发的T细胞反应将被各种免疫抑制细胞（例如，与癌症相关的成纤维细胞、血管内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关中性粒细胞、抑制性髓细胞、调节性T细胞和调节性B细胞）和免疫抑制调节因子（例如，PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO-1、TGF-β、IL-10和IL-35）大大减慢。在这种情况下，需要联合疗法来有效控制肿瘤。疫苗接种使免疫学上的“冷”肿瘤转变为“热”表型，并在TIME中诱导PD-L1上调。这种现象指导了PD-1/PD-L1阻断和个性化疫苗接种的结合。评估pembrolizumab联合新抗原疫苗治疗黑色素瘤的临床试验NCT03897881正在进行中，但未招募患者；例如，研究正在进行中，参与者正在接受治疗或正在被评估，但没有被录取。同样，癌症疫苗在临床前与抑制其他抑制分子（例如，CTLA-4、TIM-3、LAG-3、IDO或TGF-β）的抑制和刺激共刺激分子（例如，GITR、OX40和CD137）的协同作用。此外，一项针对胶质母细胞瘤的I期临床试验（NCT02709616）测试了个性化疫苗与替莫唑胺和放疗的结合。最近，Huang等人建立了一个流程来构建肿瘤免疫亚型，这些亚型作为生物标志物，反映了肿瘤及其TIME中的免疫状态（例如，免疫浸润和功能，以及免疫检查点和免疫细胞死亡调节因子的表达）。免疫亚型可能为与mRNA疫苗的联合合作提供精确指导，需要进一步的临床研究。

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