1. 引言

由于大量使用化石资源导致的温室气体（GHG）排放量迅速增加，为了在减少净二氧化碳排放的同时维持当前经济活动，迫切需要生产可再生能源。与其他可再生能源相比，包括太阳能、风能、潮汐能、地热能和水能，通过生物精炼生产的生物燃料依赖于燃烧来释放其能量，因此它是可储存的，并且与当前的化石燃料基础设施兼容。包括政府间气候变化专门委员会（IPCC）在内的许多研究人员都设想了生物燃料在替代化石燃料和缓解气候变化方面的重要作用。然而，由于化石资源价格的波动和生物工程的低通量，除了生物乙醇之外的生物燃料的商业化仍然面临挑战。

合成生物学旨在整合生物学、数学、化学、生物物理学和自动化，以系统化、模块化和标准化的方式构建合成酶、电路、途径、染色体和有机体。它特别通过加速菌株工程的速度推进了生物燃料生产，产生了可以评估工业生产的原型菌株。合成生物学和自动化的组合正在彻底改变当前的生物燃料生产流程，并引领生物精炼的新纪元。例如，使用合成生物学生物基础，Casini等人在三个月内成功构建了1.2兆字节的合成DNA，构建了215个菌株，涵盖了酿酒酵母、大肠杆菌、3种链霉菌和两个无细胞系统。酵母S. cerevisiae是一个广泛使用的底盘，拥有许多可用的合成生物学工具和长期的生物燃料生产历史，特别是乙醇生产，因此已被评估用于生产一系列化学品。在此，我们将讨论S. cerevisiae在生物燃料生产的设计-构建-测试-学习（DBTL）循环中的最新成就，并展望挑战和未来研究方向，以促进生物燃料生产的进展。

2. 生物燃料生产的设计

合成生物学的设计阶段包括模型构建、数据挖掘、合成启动子、终止子、酶的序列设计、途径和代谢的代谢设计，以及细胞生产和发酵的过程设计（图1）。

酵母合成生物学与生物燃料生产

随着大量组学数据和生物基础数据的可用性，已经开发了模型构建工具，包括用于构建基于生化约束的模型的COBRA和用于构建13C代谢通量分析模型的FluxML。此外，PartsGenie是一个开源在线软件，用于优化合成生物学部件，连接设计、优化、应用、存储算法和数据库。MAPPs可用于将参考网络映射到图形中，并搜索两个代谢物之间的最短路径。novoPathFinder可用于在特定约束下基于计量网络设计途径。机器人编程语言PR-PR可用于生物基础中的程序标准化和共享，并简化协议和设备之间的通信。

原料转化为生物燃料是一个非线性和多尺度的过程，质量守恒、构建模块的供应、能量和辅因子、热力学可行性、酶动力学、细胞生长、生物燃料生产、生物燃料运输以及应激反应都需要平衡和优化。在自动化辅助合成生物学的背景下，基于模型的分析已被广泛用于途径预测、资源分配、代谢特性和优化，以提高生物燃料生产。已经构建了各种模型，如基因组规模的代谢模型（GEMs）、动力学模型、粗粒化细胞模型来设计资源分配。最近，构建了一个全细胞模型WM_S288C，扩展了酵母GEM模型，涵盖了15种细胞状态，如RNA、蛋白质、代谢物、细胞几何形状，以及26种细胞过程，如复制、形成、消耗、相互作用和运输。这个模型已经证明了能够在1秒的时间尺度上模拟实时的细胞景观。此外，杨等人通过整合自然反应数据库MetaCyc和非自然反应数据库ATLAS，建立了一套复杂的代谢反应集，并使用组合计算算法挖掘和设计一碳化合物利用途径。通过评估动力学陷阱、挖掘新酶和优化热力学，已在体外构建了一条碳利用率为88%的途径。

3. 构建生物燃料生产的菌株

合成生物学的构建阶段涉及DNA组装、基因组编辑、基因组调控和自动化（表1）。最近开发的自动化平台大大加快了我们在重建工程菌株方面的能力，但自动化需要开发简单、模块化、多路复用和高效的技术。

表1 基于酵母的生物燃料生产的最新进展

自动化友好的DNA组装工具包括使用位点特异性DNA甲基转移酶与内切酶一起使用的甲基转移酶辅助BioBrick，允许在不进行凝胶纯化的情况下连续构建，利用I型内切酶的Golden Gate，能够在单一反应中组装24个片段，无需酶的体外DNA组装方法Twin-Primer Assembly (TPA)，可以组装10个片段，对连接错误和GC含量不敏感，基于同源的体外方法Gibson和NEBuilder组装，能够克隆高GC含量的大DNA片段，使用桥接寡核苷酸提供重叠并允许在连续步骤中自动组装的Ligase Cycling Reaction (LCR)，以及依靠S. cerevisiae的高同源重组效率的酵母体内组装。这些DNA组装工具中的许多已经被用于自动化。例如，Q-metric已经开发出来，标准化自动化DNA组装方法，并根据输出、成本和时间计算合适的组装机器人实践、指标和协议。Amyris公司成功地使用基于转化相关重组（TAR）的生物基础，每周组装1500个DNA构建，保真度超过90%。

高效且可多路复用的基因组工程工具包括多重基因组干扰、整合、碱基编辑、SCRaMbLE、自动化。详情可参考最近的综述。例如，张等人报告了高效的GTR-CRISPR系统，该系统能够在3天内同时干扰六个基因，并在10天内将酵母产生游离脂肪酸的能力提高30倍。此外，基于合成酵母基因组中大量的loxP位点，SCRaMbLE显著提高了酵母对乙醇和醋酸的耐受性。斯等人利用自动化辅助的基因组规模调控，使用过表达和敲减cDNA库，并成功筛选出针对纤维素酶表达和异丁醇生产的突变体。

4. 测试生物燃料生产的菌株

合成生物学的测试阶段涉及细胞培养、细胞分选和细胞分析，自动化也对测试工作流程提出了特殊要求。对于细胞培养，深孔96孔板允许在保持温度和氧气供应的条件下进行高通量培养。此外，与机器人技术集成的BioLector系统允许实时控制细胞生长、pH值和溶解氧。高通量细胞分选通常需要与细胞生长相关的表型，如筛选底物利用和宿主稳健性，或者可以通过荧光发射读取的表型。板阅读器、微流体学、荧光激活单细胞分选等设备可用于高通量细胞筛选。生物传感器通常被开发和利用，将筛选目标转化为易于检测的荧光表型（表1）。当前使用的生物传感器可分为基于核糖开关的生物传感器、基于报告蛋白的生物传感器和基于转录因子的生物传感器。例如，达比安等人开发了一种基于FadR的生物传感器，并证明了RTC3、GGA2和LPP1的过表达可以将脂肪酸-CoA的产生提高80%。鲍曼等人开发了一种基于辛酸响应的PDR12启动子的生物传感器，并证明了KCS1和FSH2的过表达可以提高支链高级醇辛酸的产量55%。

如果表型不能与细胞生长或荧光读出相关联，就必须使用色谱、光谱和质谱等传统分析测量，但这些不适合高通量分析，因为它们通常每个样本需要超过20分钟，因此与高通量筛选和自动化不兼容。研究人员因此专注于开发先进的分析技术和平台。例如，菲亚尔科夫等人报告了一种LTM-LPGC-MS技术，允许在每个样本不到1分钟的时间内高效测量脂肪酸甲酯。同样，薛等人报告了一种基于菌落的筛选方法，使用MALDI-ToF MS，允许在每个样本2秒的时间内快速分析中链脂肪酸。

5. 对工程菌株的学习

合成生物学的学习阶段涉及系统生物学分析和机器学习（表1）。自动化平台可以生成大量数据，这些数据需要被分析并整合回设计阶段，以通过标准化程序（图2）完善模型并指导后续迭代的DBTL循环。贾亚科迪等人进行了实验室进化和系统分析，并建议需要大分子保护机制和解毒机制来缓解醛类毒性。于等人通过系统和合成生物学工程重新编程了酵母的酒精发酵为脂肪生成，并成功将游离脂肪酸的产量提高到30 g/L。霍恩舒等人开发了一个与mRNA丰度数据集成的动态通量平衡模型，并建议乙醛酸途径是提高木糖利用中乙醇生产的关键。为了促进学习，全球生物基础联盟于2019年成立，以在实验室和非商业生物基础之间共享知识和资源。

合成生物学的设计-构建-测试-学习循环

基于约束模型的机器学习和定量生物学在识别基因型和表型之间的相关性方面也取得了显著进展。机器学习领域已经开发了多种技术来分析大量数据，包括无监督学习和降维。Radivojevi等人开发了一个基于机器学习和概率建模技术的自动化推荐工具，并提高了柠檬烯、毕萨波伦和十二烷醇的生产。此外，自动化学习技术的发展对于实现自动化过程中微生物细胞工厂的迭代工程尤为重要。为了满足这一需求，Mohammad等人开发了一个完全自动化的平台BioAutomata，该平台将机器学习算法与iBioFAB机器人系统集成。作为一个引人注目的概念验证，该系统可以自动指导迭代DBTL循环，以积累有益的工程，用于生物生产。

6. 展望

测序和生物信息学分析技术的快速发展允许从不同生物体混合和匹配途径设计，以及全细胞分析和优化碳和氮通量分布、构建模块和能量平衡、细胞资源分配、转录和动力学细胞响应。

然而，基于自动化的DBTL循环的持续发展仍然必要，因为开发可用于工业生产生物燃料的菌株的成本仍然很高，需要降低成本以支持以低成本生产生物基燃料和化学品。自动化允许大规模原型制作和相关遗传和过程变量的组合分析，大大减少了操作偏差以及时间和人力投资。然而，许多设计的途径和计算的产量尚未实现。在自动化合成生物学和生物燃料生产的背景下，未来的研究方向包括通过整合高通量数据和机器学习来完善当前模型预测。此外，朝着构建包含越来越多细胞过程的约束和动力学基础模型的发展，即朝着全细胞描述的方向发展，将提高模型的预测能力，并可能导致更好的设计工具。此外，提高方法和平台之间的标准化和互操作性以鼓励实验室间合作也将推进构建和测试工具的发展，从而加快不同设计策略的评估。在这里，开发具有广泛动态范围和对各种条件鲁棒的生物传感器的进步很重要，同时能够实时获取组学数据的能力将更好地指导设计。最后，加强沟通、建立公共数据库和软件，将确保发布的数据更广泛地为研究社区所用，这里确保原始数据更易发现、可访问、可互操作和可重用（FAIR）的趋势极为宝贵。

有了这些发展，我们相信合成生物学将能够在未来促进更高效的细胞工厂的开发，用于生物燃料生产，这将导致为我们的社会建立更可持续的交通燃料生产。

撰稿人 | 知识搬运工

责任编辑 | 邵丽竹

审核人 | 何发